目的 多种原因，包括周围血管损伤、主动脉瘤手术、断肢再植等疾病治疗过程均可造成肢体缺血。恢复充足的血供是缺血组织成活的关键，然而缺血再灌注(ischemia-reperfusion，I／R)损伤却可能导致远隔器官(如心、肺、肝、肾、小肠等)的损伤。目前，I／R后肢体及远隔脏器损伤的确切机制尚不清楚。近年研究发现，多型核粒细胞(polymorphonuclear neutrophil，PMN)的黏附、浸润及炎性介质的释放在骨骼肌I／R及其所致远隔脏器损伤过程中起关键作用。细胞黏附分子(ICAM)-1的表达则是介导PMN黏附、聚集并发挥作用的先决条件，而作为转录因子的核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)的激活是上述基因表达的前提。 为研究骨骼肌I／R后NF-κB及其相关基因在骨骼肌及远隔脏器中表达的变化规律，探讨其机制及意义，同时通过局部灌注NF-κB decoy寡核苷酸及吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)抑制NF-κB及其相关基因的表达激活，检测骨胳肌及远隔脏器损伤的改变，为防治I／R所致骨骼肌及远隔脏器功能的损害提供理论依据。 方法 1．动物模型、分组及处理 雄性Wistar大鼠，体重250g±50g，随机分为：假手术组(Sham，6只)，缺血组(ischemia，6只)，缺血再灌注组(I／R，42只)。2％戊巴比妥钠40mg／kg行腹腔注射麻醉，分离股动脉并用无创性血管夹夹闭4h。I／R组分别于再灌注1、2、4、8、12、24、48 h股静脉采血，并取胫前肌、双侧肾及肺。另外还有PDTC组(100 mg／kg，12只)、NF-κB decoy组(200μg，12只)及杂码(Scramble decoy)组(200μg，12只)，在再灌注前分别施加相应的处理因素，再灌注8 h、24 h后取材。 2．组织学研究 标本收集后，取部分骨骼肌、肾、肺叶，10％中性福尔马林固定、石蜡包埋，切片，苏木素-伊红染色。计数肺泡间隔中的PMN数代表肺部扣押的PMN。 3.肺组织湿/干重比率 取部分肺置入真空干燥器中烘烤24h，称量组织重量。计算肺组织湿/干重比率作为肺水肿的标志。 4.MDA和MPO的检测 参照丙二醛(MDA)或髓过氧化物酶(N田O)试剂盒说明检测肺、肾组织的MDA和MPO，分别作为脂质过氧化和PMN浸润的指标。 5.半定量Rl’- PCR 采用Trizol提取总RNA，逆转录为cDNA，进行PCR扩增。PCR条件:94oC变性2 min，94 oC 3 05，5 5 oC 305，72oC 455，共30个循环，72oC延伸5 min。2%琼脂糖电泳，凝胶成像系统上摄像并分析吸光度值。 基因表达值=NF一忍p65(ICAM一1，I一沼p)/p一actin 6.原位杂交 标本固定、脱水，ocT包埋后冰冻切片。按照NF一虑p65 mRNA或ICAM一1 mRNA检测试剂盒说明进行染色。光镜观察:400x镜下，计数单位视野内阳性细胞数占总细胞数百分比。 7.M触stem blot蛋白印迹 剪碎组织后置于裂解液中机械匀浆并提取总蛋白，测总蛋白质浓度。10%SDS一聚丙烯酞胺凝胶电泳、转膜。5%脱脂奶粉封闭，一抗NF一忍p65、I一出p、IeAM一l、TNFa或aet认(1:一000)，4oC过夜，洗膜，加入过氧化物酶标记的马抗山羊IgG.HRp，洗膜后加ECL，暗室显影后冲洗胶片。凝胶成像分析系统上摄像分析，计算出吸光度值。 8.免疫组织化学染色 石蜡切片，常规脱蜡至水;按试剂盒说明染色。光镜观察:400x高倍镜下，计数单位视野内阳性细胞数占总细胞数百分比。 9.统计学分析 结果用*士s表示，采用SSPS10.0软件分析各组数据，组间比较采用t检验。结果 组织形态学改变 缺血组的骨骼肌纤维间隙增宽，部分肌纤维水肿、变性;再灌注1一8h，毛细血管扩张充血，在组织中有较多白细胞浸润，肌纤维水肿;再灌注8~12h，肌纤维变形、变粗，结构模糊，肌溶严重，可见大量白细胞浸润;再灌注24~48h，肌纤维水肿、变性有所改善，逐渐恢复正常;假手术组无明显变化。 再灌注4h，肾脏即出现组织学改变，表现为肾小管上皮细胞水肿，8一12h表现最为明显，48h基本恢复正常。再灌注4h，I瓜组肺组织病理切片提示有明显的弥散功能障碍，表现为间质浸润细胞增多并伴有水肿，肺毛细血管床内可见大量的PMN聚集、附壁。肺泡中有淡红色渗出液及PMN渗出，局部肺不张，再灌注12h尤其明显。假手术组和缺血组的肺或肾小管和肾小球结构无明显改变。 再灌注sh，NF一出decoy组和PDTc组的骨胳肌、肺及肾小管上皮细胞水肿明显缓解，间质浸润的炎性细胞亦减少;24h骨胳肌、肺及肾组织学改变基本恢复正常。 2.血浆BUN、Cr及肺PMN、组织率(w/T)的改变 I瓜组各时点，血浆中BUN、Cr较假手术组和缺血组明显增加，差异有非常显著意义(P<0.01)。I瓜组肺组织湿/干重增高，再灌注24h最为明显，与假手术组和缺血组比较差异均有显著意义(P<0.01)。肺泡间隔中的PMN计数在I瓜组均显著增加。NF一沼decoy和PDTC处理能够改善肾功能，减轻肺PMN扣押和湿/干重比。 3.MDA、MPO的检测 1爪组肾或肺组织MDA和MPO活性显著增高，与缺血组比较差异有显著意义(P<0.01)。早在再灌注4h即明显增高，12?