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乙醛酸是重要的有机中间体，由于其分子内同时具有醛基和羧基，可与多种化合物发生缩合反应和环合缩合反应，具有广泛的用途。生物法生产乙醛酸具有污染少，转化率高，产品纯度高等优点，因此有望部分取代化学法。目前生物法生产乙醛酸主要是利用乙醇酸氧化酶将乙醇酸氧化成乙醛酸，同时还要加入过氧化氢酶消除反应产生的过氧化氢，防止产物的进一步氧化。在本研究的目的就是用基因工程的手段构建一种能够催化乙醇酸氧化成乙醛酸的工程菌，主要内容包括菠菜乙醇酸氧化酶基因的克隆和在大肠杆菌中的表达，过氧化氢酶的表达以及这两种酶在同一个宿主细胞内共表达的研究。首先从菠菜中提取总RNA，然后采用反转录-PCR技术从中分离扩增了乙醇酸氧化酶(GO)基因的cDNA序列，并克隆到质粒pMD18-T上，DNA测序结果证明克隆的基因序列与文献报道的菠菜乙醇酸氧化酶基因的序列完全一致。之后又将乙醇酸氧化酶的cDNA分别亚克隆至表达载体pThioHisC、pBV220、pTIG-Trx和pET-2b(+)，得到乙醇酸氧化酶表达载体pThioHisC-GO、pBV-220-GO、pTIG-Trx-GO和pET-2b(+)-GO。前两个表达重组质粒转化大肠杆菌DH5α，后两个重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，并对重组乙醇酸氧化酶在大肠杆菌中的诱导表达进行了研究。SDS-PAGE和酶活分析表明，菠菜乙醇酸氧化酶在E. coli BL21(DE3)／(pTIG-Trx-GO)和E. coli BL21(DE3)／(pET-2b(+)-GO)里得到了高水平的表达，其中E. coli BL21(DE3)／(pET-2b(+)-GO)的乙醇酸氧化酶活性较高，达到了42U／g菌体， 北京化工大学硕士学位论文超过了文献报道的菠菜乙醇酸氧化酶在大肠杆菌中表达的酶活(3 OU/g菌体)。接着又在大肠杆菌中表达了幽门螺杆菌的过氧化氢酶，SDS一PAGE和酶活测定表明过氧化氢酶同样也得到了较高水平的表达，菌体的酶活达到500一600U/mg菌体。最后尝试了将这两种酶在同一个大肠杆菌宿主细胞内表达的研究，包括将两种酶的表达载体同时转进大肠杆菌和在同一个载体上表达两种酶的基因这两个策略，目前还没有成功地实现这两个酶基因的同时表达。