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目的:以往对缺血性脑损伤引起的认知功能障碍的研究,往往忽略了造模引起的视觉损伤对认知功能障碍的影响。本研究改良了传统的开颅电凝法脑缺血模型及四血管阻断(4-vessel occlusion,4VO)全脑缺血模型,建立了改良的开颅脑缺血再灌注模型、改良的4VO连续阻断模型与4VO间断阻断模型。此外,又选择经典的Longa线栓阻断模型、SD与Wistar大鼠的双侧颈总动脉结扎模型,比较上述缺血模型中的主要脑损伤及视网膜损伤的差异。在此基础上,选择Longa线栓阻断法作为大鼠脑缺血伴视网膜损伤的动物模型,玻璃体腔内注射δ-阿片受体(delta opioid receptor,DOR)拮抗剂naltrindole,通过组织病理学检查及行为学检测,观察电针大鼠“水沟”、“睛明”穴,对视网膜损伤是否存在神经保护作用,并探讨电针的保护作用与DOR之间是否存在关系。方法:第一部分:常用大鼠脑缺血模型对视网膜损伤的比较研究在第一部分的研究中,首先针对经典开颅电凝法脑缺血模型不能进行再灌注研究的缺点进行了模型改良,建立了新的大鼠开颅脑缺血再灌注模型;针对Pulsinelli建立的4VO模型死亡率高,电凝不全、易伤及脑干及脊髓等缺陷,进行了技术创新,建立新的4VO连续阻断模型与4VO间断阻断模型。在此基础上,选择经典的Longa线栓阻断法模型、SD与Wistar大鼠的两血管阻断(2-vessel occlusion,2VO)模型,比较上述模型中的主要脑缺血及视网膜损伤差异。各模型均分别分为假手术组、D1模型组、D3模型组、D7模型组、D14模型组、D28模型组,于造模1、3、7、14、28天取材,脑及视神经离体样本经HE染色(hematoxylin and eosin staining)与LFB染色(luxol fast blue staining)检查组织病理学改变,眼球离体样本经HE染色进行组织病理学观察并对视网膜各细胞层进行厚度分析与视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)细胞密度分析。D28模型组于术后28天使用明暗箱检测大鼠的光线辨识能力,Y迷宫检测学习记忆能力的改变。综合脑、视神经、视网膜的组织病理学检测结果与神经行为学的检测结果,从而评价上述模型在脑损伤与视网膜损伤中的差异。第二部分:δ-阿片受体在电针治疗大鼠脑缺血伴随的视网膜损伤中的作用研究在第二部分研究中,选用Longa线栓阻断法造模,将30只大鼠随机分为假手术组(Sham)、MCAO模型组(MCAO)、MCAO模型电针治疗组(MCAO-E)、MACO模型假电针组(MCAO-S)、MCAO模型+电针治疗+拮抗剂naltrindole组(MCAO-E-N),每组6只。Sham组、MCAO组、MCAO-E组、MCAO-S组于造模前30 min玻璃体腔内注射生理盐水10μl,MCAO-E-N组玻璃体腔内注射10μl的100 n M拮抗剂naltrindole。电针穴位选取“睛明”和“水沟”,MCAO-E、MCAO-E-N组于缺血30 min时开始电针治疗,并持续至再灌注后30 min,假电针组仅刺入大鼠穴位,不予通电。24 h后取材,CV染色(crystal violet staining)观察脑梗死的组织病理改变并计算脑梗死体积比。眼球离体样本经HE染色进行组织病理学评价并对视网膜各细胞层进行厚度分析与RGCs细胞密度分析,视网膜免疫荧光染色观察胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)的阳性表达并进行平均光密度值分析。从而评价电针对于视网膜损伤的改善作用,并探讨这种改善作用是否与DOR有关。结果:第一部分:常用大鼠脑缺血模型对视网膜损伤的比较研究改良的开颅阻断法模型术后脑组织病理学检测发现,该模型的脑梗死区域仅局限于皮层,而纹状体、海马、脑白质未观察到组织病理学改变,视神经、视网膜亦未观察到组织病理学改变,D28的明暗箱、Y迷宫检测未观察到神经功能损伤。线栓阻断法模型采用经典的Longa造模方法,术后1天脑皮层、纹状体即观察到明显的缺血性改变,甚者累及海马区域及脑白质,其后缺血损伤呈渐进性加重。视网膜的HE染色检测,术后1天外核层(outer nuclear layer,ONL)出现了有显著性的细胞层增厚(P?0.05),术后3天观察到了2只动物的内核层(inner nuclear layer,INL)的空泡形成,其他阶段未观察到明显的视网膜组织病理学的改变。视网膜GFAP、GS免疫荧光标记染色术后1天即开始观察到明显的阳性表达。D28的Y迷宫、明暗箱检测未观察到动物在学习记忆与光线辨识能力上的神经功能损伤。SD大鼠2VO模型,脑缺血损伤区域主要为脑灰质(海马)以及白质(视束),术后28天有2只大鼠观察到海马CA1区缺血性改变,而皮层、纹状体各阶段未观察到明显的缺血性改变。术后1天可见视神经神经纤维缺血损伤,随后28天渐进性加重。视网膜术后1天即可观察到视网膜组织病理学改变,主要改变可见于神经节细胞层(ganglion cell layer,GCL)与外核层,其后缺血改变渐进性加重,至术后28天视网膜的损伤明显,主要损伤可见于神经节细胞层、内网状层(inner plexiform layer,IPL)及外网状层(outer plexiform layer,OPL),细胞层厚度与假手术组之间的差别有统计学意义(P<0.001);RGCs数量变少,细胞密度与假手术组之间的差别有统计学意义(P<0.001)。术后28天的Y迷宫检测结果显示大鼠存在学习记忆损伤。Wistar大鼠2VO模型,脑缺血损伤区域主要为脑白质,尤其是视束,术后3天即可观察到神经元损伤,而各阶段的海马、皮层、纹状体未观察到明显的缺血性改变。视神经术后1天可见神经纤维缺血损伤,随后28天缺血损伤渐进性加重。视网膜术后1天即可观察到视网膜组织病理学改变,主要改变可见于GCL、IPL、INL、ONL,其后缺血改变渐进性加重,至术后28天视网膜的损伤明显,主要损伤可见于神经节细胞层、内网状层、内核层、外网状层、感光细胞层(photoreceptor layer,PL)及视网膜色素上皮层(retinal pigment epithelium,RPE),视网膜总厚度及各细胞层厚度与对照组之间的差别有统计学意义(P<0.001),RGCs数量变少,细胞密度与对照组之间的差别有统计学意义(P<0.001)。术后28天的明暗箱检测结果显示大鼠存在视觉功能损伤。改良的4VO连续阻断模型,分离并结扎双侧第1颈椎与第2颈椎间隙中穿过的椎动脉,术后24 h连续夹闭颈总动脉20 min行四血管阻断造模。术后脑缺血损伤区域主要为海马CA1区,术后1天海马CA1区开始观察到锥体细胞缺血损伤,随后损伤持续加重,海马CA3与DG区、皮层、纹状体、白质区域无缺血性改变。视神经、视网膜亦未观察到组织病理学改变。术后28天的Y迷宫检测结果显示大鼠存在学习记忆损伤。改良的4VO间断阻断模型,分离第1颈椎与第2颈椎间隙中穿过的椎动脉,使用动脉夹同时阻断双侧椎动脉与颈总动脉,缺血5 min再灌注5 min,循环3次进行4VO间断阻断造模。术后脑缺血损伤区域主要为海马CA1区,术后1天海马CA1区开始观察到锥体细胞缺血损伤,随后损伤持续加重,海马CA3、DG区神经元未观察到缺血性改变。皮层、纹状体、白质区域无缺血性改变。视神经、视网膜亦未观察到组织病理学改变。术后28天的Y迷宫检测结果表明大鼠存在一定的学习记忆损伤。第二部分:δ-阿片受体在电针治疗大鼠脑缺血伴随的视网膜损伤中的作用研究在第二部分的研究中,Longa线栓阻断法造模后24 h的大脑CV染色结果显示MCAO-E、MCAO-S、MCAO-E-N脑梗死体积与MCAO组之间的差别没有统计学意义(P>0.05)。视网膜组织病理学检测,MCAO组、MCAO-S组、MCAOE-N组ONL、INL细胞层增厚,与假手术组之间的差别有统计学意义(P?0.05),MCAO-E组未检测到有显著性的增厚。GFAP免疫荧光检测结果可见,MCAO组、MCAO-S组、MCAO-E-N组GCL/NFL层大量表达GFAP,MCAO-E组视网膜仅在GCL/NFL层有微弱GFAP表达。GS免疫荧光检测结果可见,MCAO组、MCAOS组、MCAO-E-N组于GCL/NFL、IPL、INL、OPL、ONL层大量表达,MCAO-E组视网膜仅在GCL/NFL、INL、ONL层有GS表达。提示电针治疗对视网膜损伤有改善作用,而这种改善作用能被naltrindole翻转。结论:1.缺血模型的比较结果显示,开颅脑缺血再灌注模型观察到皮层损伤,改良的4VO连续阻断模型、改良的4VO间断阻断模型,观察到灰质(海马)损伤,但均未观察到白质及视网膜损伤;SD大鼠2VO模型,观察到灰质(海马)、白质损伤并伴有视网膜损伤、Wistar大鼠2VO模型观察到白质损伤并伴有视网膜损伤,而灰质(海马)无明显损伤;Longa线栓阻断法模型观察到皮层、纹状体甚至灰质(海马)、白质损伤并伴随有视网膜损伤。2.电针“水沟”、“睛明”穴对脑缺血伴随的视网膜损伤具有明显的保护作用,而眼球玻璃体注射DOR拮抗剂naltrindole可以翻转电针的保护作用,提示DOR可能在电针抗视网膜损伤中是一关键环节。