【摘 要】
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嵌合酶是指由两种或两种以上酶的不同功能片段融合而成并呈现出新催化特性的酶分子。其出现及其相关技术的发展为酶工程的研究和应用提供了新策略。利用蛋白质工程技术构建嵌合酶来实现酶的底物选择偏好性改变一直是科学研究热点。基于此,本研究以Rhizomucor miehei来源的脂肪酶RML为研究对象,与实验室前期研究已挖掘出具有磷脂酶活力调控功能的蛋白元件嵌合,构建系列新型嵌合脂解酶,开展其酶学性质表征研究
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嵌合酶是指由两种或两种以上酶的不同功能片段融合而成并呈现出新催化特性的酶分子。其出现及其相关技术的发展为酶工程的研究和应用提供了新策略。利用蛋白质工程技术构建嵌合酶来实现酶的底物选择偏好性改变一直是科学研究热点。基于此,本研究以Rhizomucor miehei来源的脂肪酶RML为研究对象,与实验室前期研究已挖掘出具有磷脂酶活力调控功能的蛋白元件嵌合,构建系列新型嵌合脂解酶,开展其酶学性质表征研究,重点考察磷脂酶活力变化及底物选择偏好性的变化规律。相关研究为脂解酶的结构功能关系研究提供了良好的基础,为利用蛋白元件设计酶分子强化催化性能提供科学指导依据。具体研究内容及结果如下:（1）基于蛋白元件重构的新型嵌合脂解酶的设计、制备及酶学性质表征。通过对4个蛋白元件的排列、重复、组合,共设计5个嵌合体（1-5号嵌合体）。构建嵌合体毕赤酵母表达菌株,通过高密度发酵培养、阴离子交换层析纯化获得嵌合体重组蛋白,表征嵌合体的脂肪酶和磷脂酶活力。结果显示,5个嵌合体的磷脂酶活力均有不同程度的提升,其中5号嵌合体的磷脂酶比活力为35.77 U/mg,是野生型的82倍。2号嵌合体的磷脂酶比活力为27.10 U/mg,其磷脂酶比酶活力/脂肪酶比酶活力为1.11,更加偏好水解磷脂底物。（2）基于活性口袋周围微环境重构的嵌合酶设计、制备及酶学性质表征。对位于嵌合体活性口袋周围的非极性氨基酸和带电氨基酸开展极性和带电性改造,重构活性口袋微环境,共设计14个嵌合酶突变体,对其脂肪酶和磷脂酶活力进行表征。结果显示,提高活性口袋周围微环境的极性或电负性均有利于进一步提高嵌合酶对磷脂底物的水解能力。其中,突变体H的磷脂酶比活力为69.52 U/mg,是野生型的160倍。研究发现通过改变反应温度可调控突变体H底物偏好性。当反应温度为20℃时脂肪酶水解活力最高,40℃时磷脂酶水解活力最高。将突变体H应用于大豆毛油脱胶中,在加酶量10 U/g,反应温度45℃,p H 4.0的条件下,反应6 h大豆毛油中的磷含量由162.0mg/kg降至9.2 mg/kg。（3）嵌合脂解酶底物选择性机制研究。通过蛋白质结构预测,分别模拟出突变体H闭合和开放构象的三维结构。进行突变体H和RML WT与磷脂底物和甘油三酯底物的分子对接,结果显示突变体H与两种底物的结合能均大于RML WT。突变体H嵌合的蛋白元件位于活性口袋上方,有助于加强底物与活性口袋的结合。嵌合的蛋白元件上的极性氨基酸有助于固定磷脂底物的亲水头部,使磷脂底物结合在正确位置,促进活性中心对磷脂底物的水解。
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