【摘 要】
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作为人类蛋白质和食用油脂的重要来源,大豆（Glycine max）在农业生产中占有重要地位。但现在我国大豆产业正在面临着自给率连续下跌,干旱、土壤盐渍化等逆境胁迫极大制约着大豆产量的增长。充分利用植物的抗逆基因培育新的高抗性品种,是提高植物抗逆性最根本、最经济、最有效的方法。而大豆抗逆相关基因的挖掘及功能研究是大豆抗逆新品种培育的重要基础。长链非编码RNA（long non-coding RNA,
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作为人类蛋白质和食用油脂的重要来源,大豆（Glycine max）在农业生产中占有重要地位。但现在我国大豆产业正在面临着自给率连续下跌,干旱、土壤盐渍化等逆境胁迫极大制约着大豆产量的增长。充分利用植物的抗逆基因培育新的高抗性品种,是提高植物抗逆性最根本、最经济、最有效的方法。而大豆抗逆相关基因的挖掘及功能研究是大豆抗逆新品种培育的重要基础。长链非编码RNA（long non-coding RNA,lnc RNA）通常是指长度大于200bp,缺乏开放阅读框,没有蛋白质编码能力的非编码RNA。lnc RNA作为转录调控网络的重要组成部分,在植物逆境应答中发挥重要作用。但是目前在植物中lnc RNA的功能研究依然比较少。前期通过对正常条件和盐胁迫处理的大豆根系进行了转录组测序,本研究在此基础上挑选了盐胁迫下变化倍数比较大的两个lnc RNAs及其反义（antisense）靶基因。发根农杆菌（A.rhizogenes）K599介导的大豆遗传转化体系与传统的遗传转化方法相比具有转化效率更高,过程简单,不容易污染和周期短的特点,该方法可用于基因功能的研究。本研究用同源重组的方法将筛选到的lnc RNA及其靶基因克隆到p GFPGUS载体上,用35S驱动其过表达,随后转入发根农杆菌K599形成大豆转基因复合体。通过分析大豆转基因复合体对高盐胁迫的响应,研究lnc RNA的功能。主要研究结果如下:1.qRT-PCR分析结果表明:盐胁迫条件下,lncTCONS＿00072963及其靶基因Gm EGY1分别上调和下调表达;lncTCONS＿00042461及其靶基因Gm TFIIIC分别下调和上调表达,与转录组测序分析结果一致。2.大豆毛状根中过表达lncTCONS＿00072963:盐胁迫条件下大豆过表达复合体的耐盐能力高于空载对照复合体。主要表现在以下几个方面:用DAB和NBT对复合体叶片染色发现,过表达复合体的叶片中H2O2和O2-含量少于空载对照复合体;叶绿素含量高于空载对照复合体;而电解质渗出率低于空载对照复合体。通过对丙二醛含量测定发现,过表达复合体的根中过氧化物含量少于空载对照复合体;茎和叶中Na+/K+显著低于空载对照。以上结果说明在大豆毛状根中过表达lncTCONS＿00072963显著提高了转基因复合体的耐盐能力。3.同样的方法,大豆毛状根中过表达lncTCONS＿00072963的反义靶向基因Gm EGY1,过表达复合体的耐盐能力降低,主要表现为:盐胁迫条件下,转基因复合体叶片中H2O2含量和电解质渗出率显著高于空载对照,而叶绿素含量低于空载对照;转基因复合体根、茎、叶中Na+/K+显著升高;根中MDA含量增加。上述结果说明,在大豆毛状根中过表达Gm EGY1基因会显著降低转基因复合体的耐盐能力。4.大豆发状根中过表达lncTCONS＿00042461,盐胁迫条件下,转基因复合体叶片中H2O2的积累增多,叶绿素含量降低,电解质渗出率升高;过表达复合体根和叶中Na+/K+显著高于空载对照复合体;根中MDA含量高于空载对照复合体。以上结果说明,过表达lncTCONS＿00042461显著降低了转基因复合体的耐盐能力。5.大豆毛状根中过表达lncTCONS＿00042461的反义靶向基因Gm TFIIIC,过表达复合体的耐盐能力增强,表现在以下几个方面:盐胁迫条件下,过表达复合体叶片中H2O2含量及电解质渗出率低于空载对照复合体,而叶绿素含量高于空载对照;叶片含水率高于空载对照复合体;过表达复合体的根中Na+/K+、MDA含量显著低于空载对照。这些结果说明,过表达Gm TFIIIC基因可以显著提高转基因复合体的耐盐能力。
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