翼齿六棱菊中倍半萜合酶基因的克隆及其功能研究

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翼齿六棱菊(Laggera crispata)俗称臭灵丹(L.pterodonta),是菊科六棱菊属植物中研究较多的物种,广泛分布于我国西南地区。其作为传统中草药,可治疗肝炎、支气管炎、疟疾、以及呼吸道病毒感染等疾病。目前的研究主要集中在翼齿六棱菊化学成分,其中占比很大的属桉烷类倍半萜,在这类倍半萜中最具代表性的为桉烷类酸中有抗病毒以及抗炎等多种活性的臭灵丹酸。臭灵丹酸作为翼齿六棱菊主要生物活性组分,是植物应对环境胁迫而产生,可用于医药。迄今为止,虽然对臭灵丹酸等少许桉烷类倍半萜的生物活性进行了相关研究,但关于该植物在环境压力作用下合成臭灵丹酸等重要活性物质的分子机制尚未见报道。本研究结合已报道的菊科其他物种的相关桉烷型倍半萜合成途径推测翼齿六棱菊中臭灵丹酸的生物合成途径,并对该途径中的吉玛烯A合酶(GAS)进行功能表征。具体研究内容包括:翼齿六棱菊叶片“3+2”模式转录组和代谢组测序及测序数据的初步分析;同源性比对、序列相似性网络、系统进化树构建及分子对接等生物信息学方法深度发掘候选倍半萜合酶基因;候选倍半萜合酶基因克隆、构建p Cold TF-目的基因重组质粒、不同宿主内低温诱导表达、体内外功能验证。主要研究结果为:通过转录组数据功能注释和差异基因表达分析筛选到了3个表达量上调较高的倍半萜合酶基因,分别为Transcript_13601、Transcript_11486、Transcript_11118,其中Transcript_13601编码吉玛烯A合酶,另外两个均编码β-石竹烯合酶;代谢组数据分析中发现了臭灵丹酸及其衍生物共4种、木香酸及其衍生物共2种、冬青酸和其他3种桉烷类倍半萜含量均上调;采用生物信息学方法深入分析挖掘到另外4个候选倍半萜合酶基因Transcript_15915、Transcript_11692、TRINITY_DN18969_c0_g4_i4、TRINITY_DN18969_c0_g5_i1;克隆上述获得的7个候选基因,最后在Top10宿主内鉴定了一个吉玛烯A合酶基因(Transcript_15915),该基因可催化FPP产生吉玛烯A的重排产物β-榄香烯。本研究可为解析翼齿六棱菊植物中臭灵丹酸完整的生物合成途径提供理论基础。
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