卵巢癌（Ovarian cancer）是妇科最常见的恶性肿瘤，具有易复发转移、易产生多药耐药(Multidrug resistance, MDR)的生物学特性。化疗是卵巢癌肿瘤减灭术基础上的一种重要的治疗手段，其中铂类化合物如顺铂(Cisplatin, DDP)，是众多药物中最经典有效的，但肿瘤的多药耐药性增加了化疗失败率。MDR是指一种药物作用于肿瘤细胞产生耐药性后，该肿瘤对未接触过的其它不同作用机理的抗肿瘤药物也产生了交叉耐药。引起MDR的原因有许多，其中凋亡调控基因的异常表达是导致卵巢癌多药耐药的主要途径之一，研究发现许多信号通路和转录因子通过提高细胞的增殖和生存能力而降低对顺铂的敏感性，其中促凋亡因子如野生型P53、Bax、Caspase-3等和抑制凋亡因子如XIAP、Survivin、Bcl-2等的多方面因素介导，进一步导致抗肿瘤药物诱导凋亡失败。其中XIAP、Caspase-3、Bcl-2和Survivin作为多药耐药相关蛋白，参与多种肿瘤多药耐药的形成。微管抑制剂诺斯卡品(Noscapine，NOS)是一种苄基异喹啉类生物碱，在过去几十年中作为镇咳药广泛应用。近年来发现诺斯卡品及其衍生物有抗肿瘤作用。有研究表明诺斯卡品可以抑制微管动态不稳定性，阻滞细胞周期，诱导细胞凋亡，对神经胶质瘤、髓细胞性白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌等都有抑制作用。其作用机制尚不完全清楚，可能涉及到了多种途径，包括抑制有丝分裂G2/M期及JNK途径激活、P53参与、caspase级联反应、线粒体途径、NF-κB信号通路调节等。一些研究还表明当紫杉醇等微管抑制剂产生耐药作用时，诺斯卡品及其衍生物仍可起到一定的抗肿瘤作用，且具有毒副作用小，无明显交叉耐药的特点，提示诺斯卡品可能具有逆转肿瘤耐药的作用。目前，有关诺斯卡品对卵巢癌顺铂耐药SKOV3/DDP细胞的逆转耐药作用尚未见报道，有待于进一步研究。本实验利用顺铂诱导卵巢癌SKOV3细胞产生耐药的方法建立卵巢癌顺铂耐药SKOV3/DDP细胞株，通过体外实验观察XIAP、Caspase-3、Bcl-2和Survivin在诺斯卡品作用后的表达情况，探讨诺斯卡品对卵巢癌顺铂耐药的逆转作用及机制；体内实验利用裸鼠皮下移植卵巢癌顺铂耐药细胞，建立裸鼠移植瘤模型，通过给予不同浓度的诺斯卡品及诺斯卡品与顺铂联合剂量，观察裸鼠移植瘤体积及组织形态学变化，同时分析诺斯卡品对裸鼠卵巢癌顺铂耐药移植瘤组织中XIAP、Caspase-3、Bcl-2和Survivin蛋白表达的影响，进一步利用多项实验方法检测四种蛋白在正常卵巢组织、交界性卵巢肿瘤组织和上皮性卵巢癌组织中的表达，并分析与卵巢癌临床病理指标的关系。期望通过探讨诺斯卡品逆转人卵巢癌SKOV3/DDP细胞多药耐药的作用机制及临床相关性，为卵巢癌顺铂耐药逆转的研究提供实验依据、开辟新的思路。方法：1卵巢癌耐药细胞系SKOV3/DDP的建立及其耐药蛋白的表达采用顺铂持续接触浓度递增的方法对SKOV3诱导，取对数生长期SKOV3细胞，于含有0.02mg/L顺铂的培养基中培养，逐步提高顺铂的诱导浓度，直到细胞能在含0.2mg/L顺铂的培养基中稳定生长，历时8个月，将其命名为SKOV3/DDP细胞。顺铂作用于SKOV3、SKOV3/DDP细胞后，采用MTT法检测两种细胞的生长抑制率，计算半数抑制浓度（IC50），从而计算耐药指数（RI）；通过流式细胞术方法（flow cytometry, FCM）检测两种细胞的细胞凋亡率及细胞中XIAP、Caspase-3、Bcl-2和Survivin蛋白的表达；Realtime-PCR方法检测细胞中XIAP、Survivin mRNA的表达。2诺斯卡品逆转SKOV3/DDP细胞对顺铂耐药作用及机制应用MTT方法检测诺斯卡品、顺铂及诺斯卡品与顺铂联合作用对SKOV3/DDP细胞的生长抑制率；应用FCM方法检测诺斯卡品、顺铂及诺斯卡品与顺铂联合作用对SKOV3/DDP细胞凋亡及细胞周期的影响，同时检测细胞中XIAP、Caspase-3、Bcl-2和Survivin蛋白的表达；应用Realtime-PCR方法检测诺斯卡品、顺铂及诺斯卡品与顺铂联合作用SKOV3/DDP细胞后，细胞中XIAP、Survivin mRNA的表达。3诺斯卡品逆转卵巢癌顺铂耐药裸鼠移植瘤作用研究将BALB/c nu/nu裸鼠（3-4周龄，雌性，16~20g）按体重随机分为10组，每组6只。其中裸鼠SKOV3/DDP和SKOV3细胞移植瘤分别为7组和3组。裸鼠皮下注射细胞，待第2周肿瘤界限清楚后，开始用药。诺斯卡品，腹腔注射，1次/3天，共注射7次；顺铂，腹腔注射，1次/3天，共注射7次。裸鼠SKOV3/DDP细胞移植瘤分组：实验组分别为20和40mg/kg诺斯卡品用药组，3和6mg/kg顺铂用药组，3mg/kg顺铂与20和40mg/kg诺斯卡品联合用药组；对照组给予生理盐水。裸鼠SKOV3细胞移植瘤分组：实验组分别为3和6mg/kg顺铂组；对照组给予生理盐水。实验期间，每隔日测量一次裸鼠移植瘤的长、短径及其裸鼠体重。停药3天后，采用拉颈法处死裸鼠，并剥离移植瘤称重，计算移植瘤体积和重量及其抑制率。采用FCM方法检测裸鼠移植瘤组织细胞的凋亡率、细胞周期及XIAP、Caspase-3、Bcl-2和Survivin蛋白的表达；免疫组织化学方法（immunohistochemistry, IHC）检测裸鼠移植瘤组织细胞中XIAP、Caspase-3、Bcl-2和Survivin蛋白的表达。4耐药相关蛋白在卵巢癌组织中的表达及其意义收集河北医科大学第四医院卵巢上皮性癌共80例，交界性肿瘤20例，正常卵巢组织15例。手术经病理结果证实的80例上皮性癌，其中浆液性囊腺癌41例，黏液性囊腺癌28例，子宫内膜样癌11例。80例标本中I、II期者38例，III、Ⅳ期者42例；高分化者39例，中分化26例，低分化15例；有淋巴转移者39例，无淋巴转移者41例。采用FCM和IHC检测上皮性癌，交界性肿瘤，正常卵巢组织中XIAP、Caspase-3、Bcl-2和Survivin蛋白的表达，分析XIAP、Caspase-3、Bcl-2和Survivin表达与卵巢癌临床病理特征的关系及及蛋白之间的关系。结果：1卵巢癌耐药细胞系SKOV3/DDP的建立及其耐药蛋白的表达通过细胞培养，镜下分析结果显示，与SKOV3细胞相比，SKOV3/DDP细胞体积变大呈多角形，神经元细胞样生长，形态更不规则，细胞质可见颗粒状囊泡，边界模糊，折光性差。MTT结果显示，顺铂作用SKOV3、SKOV3/DDP细胞24、48、72h，SKOV3细胞的IC50值为11.19mg/L、5.94mg/L、3.03mg/L，SKOV3/DDP细胞的IC50值为27.24mg/L、17.52mg/L、11.46mg/L，由IC50比较得SKOV3/DDP细胞24、48、72h的耐药指数RI为2.43、2.95、3.78。FCM结果显示，SKOV3/DDP细胞中的XIAP、Bcl-2和Survivin蛋白的表达量较SKOV3细胞显著增高（P<0.01）， Caspase-3蛋白表达量较SKOV3细胞显著降低（P<0.01）。顺铂作用SKOV3、SKOV3/DDP细胞48h，SKOV3/DDP细胞凋亡率显著低于SKOV3细胞（P<0.01）。Realtime-PCR结果显示，SKOV3、SKOV3/DDP细胞中XIAP mRNA的表达水平无明显差异(P>0.05)；SKOV3/DDP细胞中Survivin mRNA的表达显著高于SKOV3细胞，两者比较有显著差异(P<0.05)。2诺斯卡品逆转SKOV3/DDP细胞对顺铂耐药作用及机制MTT结果显示，诺斯卡品作用于SKOV3/DDP细胞24h、48h、72h，SKOV3/DDP细胞的IC50值分别为52.84μmol/L，28.04μmol/L，21.58μmol/L，诺斯卡品对SKOV3/DDP细胞的生长有明显的抑制作用，且存在着浓度和时间依赖效应(P<0.05)。诺斯卡品+顺铂联合组与单独应用诺斯卡品及顺铂组相比，对SKOV3/DDP细胞生长抑制率显著增高(P<0.05)。FCM结果显示，诺斯卡品+顺铂联合组与单独应用诺斯卡品及顺铂组相比，SKOV3/DDP细胞凋亡率显著增高(P<0.05)；G0/G1期细胞比例减少，G2/M期细胞比例显著增加(P<0.05)。诺斯卡品+顺铂联合组与单独应用顺铂组相比，SKOV3/DDP细胞中XIAP、Bcl-2和Survivin蛋白表达量均显著降低(P<0.05)，而Caspase-3蛋白表达量显著增高(P<0.05)。Realtime-PCR结果显示，诺斯卡品+顺铂联合组与单独应用顺铂组相比，SKOV3/DDP细胞中XIAP、Survivin mRNA表达量显著降低(P<0.05)。3诺斯卡品逆转卵巢癌顺铂耐药裸鼠移植瘤作用研究成功建立SKOV3细胞和SKOV3/DDP细胞裸鼠移植瘤模型，移植瘤100%成瘤。DDP作用组，与SKOV3细胞裸鼠移植瘤相比， SKOV3/DDP细胞裸鼠移植瘤体积及重量显著增加（P<0.05)。诺斯卡品+顺铂联合组与单独应用诺斯卡品或顺铂组相比，SKOV3/DDP细胞裸鼠移植瘤的体积及重量显著降低(P<0.05)。FCM结果显示，诺斯卡品+顺铂联合组与单独应用诺斯卡品及顺铂组相比，SKOV3/DDP细胞裸鼠移植瘤细胞凋亡率显著增加(P<0.05)，细胞中G0/G1期细胞比例显著减少，G2/M期细胞比例显著增加(P<0.05)。诺斯卡品+顺铂联合作用组与单独应用顺铂组相比，SKOV3/DDP细胞裸鼠移植瘤细胞中XIAP、Bcl-2和Survivin蛋白表达量均显著降低(P<0.05)，Caspase-3蛋白表达量显著增高(P<0.05)。IHC结果显示，诺斯卡品+顺铂联合作用组与单独应用顺铂组相比，SKOV3/DDP细胞裸鼠移植瘤细胞中XIAP、Bcl-2和Survivin蛋白阳性表达率均显著降低(P<0.05)，Caspase-3蛋白的阳性表达率显著增高(P<0.05)。4耐药相关蛋白在卵巢癌组织中的表达及其意义IHC结果显示：XIAP以细胞浆中出现棕黄色颗粒为阳性；Bcl-2以细胞浆和细胞膜中出现棕黄色颗粒为阳性；Caspase-3、Survivn以细胞核和细胞浆内有棕黄色颗粒为阳性。卵巢癌组织中XIAP、Bcl-2和Survivin蛋白阳性表达率（78.8%、48.8%和55.0%）和交界性卵巢肿瘤组织（60.0%、30.0%和25.0%）显著高于正常卵巢组织（0、0和6.7%）（P<0.01）。正常卵巢癌组织中Caspase-3蛋白阳性表达率（93.3%）显著高于交界性卵巢肿瘤组织（55.0%）和卵巢癌组织（43.8%）(P<0.01)。FCM及IHC结果显示，XIAP、Caspase-3、Bcl-2和Survivin蛋白在卵巢浆液性囊腺癌、黏液性囊腺癌及子宫内膜样癌组织中阳性率及表达量无显著差异(P>0.05)；高、中、低分化组四种蛋白阳性率与表达量逐渐升高，组间比较差异有统计学意义(P<0.01)。淋巴结转移组与淋巴无转移组相比，Survivin和Bcl-2蛋白阳性率与表达量显著增高(P<0.01)，XIAP和Caspase-3蛋白阳性率与表达量无显著差异(P>0.05)。临床III～Ⅳ期组与I～II期组相比，XIAP、Bcl-2和Survivin蛋白阳性率与表达量显著增高(P<0.01)，Caspase-3蛋白阳性率与表达量显著降低(P<0.01)。卵巢癌组织中XIAP与Caspase-3蛋白，Survivin与Bcl-2蛋白的表达具有相关性（P<0.01; P<0.01），XIAP与Bcl-2蛋白，Survivin与Caspase-3蛋白表达无相关性（P>0.05; P>0.05）。结论：1采用顺铂接触浓度不断递增的诱导方法，建立卵巢癌耐药SKOV3/DDP细胞。顺铂作用SKOV3和SKOV3/DDP细胞后，SKOV3/DDP细胞的抑制率和凋亡率均低于SKOV3细胞，表明SKOV3/DDP细胞产生顺铂耐药。与SKOV3细胞相比，SKOV3/DDP细胞中XIAP、Bcl-2、Survivin蛋白及Survivin mRNA高表达，Caspase-3蛋白低表达，表明这些蛋白及基因均参与了卵巢癌耐药。2初次探讨了诺斯卡品逆转卵巢癌顺铂耐药机制，国内外尚未见相关报道。诺斯卡品能有效抑制SKOV3/DDP细胞的增殖，具有时间及浓度依赖性。低剂量诺斯卡品联合顺铂提高了顺铂对SKOV3/DDP细胞的敏感性，并可诱导细胞凋亡，表明诺斯卡品对SKOV3/DDP细胞具有耐药逆转作用，其机制与下调XIAP、Survivin mRNA及XIAP、Bcl-2、Survivin蛋白表达，上调Caspase-3蛋白表达有关。3建立了SKOV3细胞和SKOV3/DDP细胞裸鼠移植瘤模型。诺斯卡品与顺铂联合组，SKOV3/DDP细胞裸鼠移植瘤的生长抑制率显著高于诺斯卡品或顺铂组，表明诺斯卡品可以逆转SKOV3/DDP细胞裸鼠移植瘤对顺铂的耐药，其逆转耐药机制与下调XIAP、Bcl-2和Survivin蛋白和上调Caspase-3蛋白在裸鼠移植瘤组织中的表达有关，证明这些蛋白参与了卵巢癌顺铂耐药。4在卵巢正常组织、交界性卵巢肿瘤和上皮性卵巢癌组织中，XIAP、Bcl-2、Survivin蛋白的阳性表达率逐渐增高，Caspase-3蛋白的阳性表达率逐渐降低。XIAP、Caspase-3、Bcl-2和Survivin蛋白的表达与卵巢癌临床分期及恶性程度密切相关。XIAP与Caspase-3蛋白和Survivin与Bcl-2蛋白在上皮性卵巢癌组织中表达具有相关性。卵巢癌顺铂耐药裸鼠移植瘤组织中四种蛋白的表达与在患者卵巢癌组织中存在相似性，表明诺斯卡品在人和裸鼠卵巢癌耐药逆转中可能具有相同作用。