【摘 要】
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蛋白质磷酸化是活细胞中最重要的翻译后修饰之一,它参与细胞周期控制、受体介导的信号转导、分化、增殖、转化和代谢等多种调节功能。通过磷酸化特异性抗体和蛋白组学等方法已经在不同类型的细胞和生物中确定了数千个磷酸化位点,研究对象主要集中在真核生物中的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸侧链羟基的磷酸化上。而羧基磷酸化形式的磷酸化天冬氨酸和谷氨酸由于其自身的化学和热不稳定性,这种修饰的广泛发现和动态量化难以实现。本文设计
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蛋白质磷酸化是活细胞中最重要的翻译后修饰之一,它参与细胞周期控制、受体介导的信号转导、分化、增殖、转化和代谢等多种调节功能。通过磷酸化特异性抗体和蛋白组学等方法已经在不同类型的细胞和生物中确定了数千个磷酸化位点,研究对象主要集中在真核生物中的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸侧链羟基的磷酸化上。而羧基磷酸化形式的磷酸化天冬氨酸和谷氨酸由于其自身的化学和热不稳定性,这种修饰的广泛发现和动态量化难以实现。本文设计并合成标记试剂AEP（2-Aminoethyl Phosphonate,β-氨基膦酸酯）及其稳定同位素标记试剂4D-AEP,来快速捕获蛋白质组中磷酸化天冬氨酸和磷酸化谷氨酸位点特有的亲电酰基磷酸基团,可用于特异性识别和广泛发现蛋白组中的羧基磷酸化位点。通过核磁共振波谱和高分辨质谱等方法对所合成标记试剂的结构进行了表征鉴定和结构优化,该结构包含具有亲核性的氨基和具有质谱增敏效应的磷酸酯基团。通过在磷酸酯基团中引入氘原子实现稳定同位素标记试剂的合成,在羧基磷酸化位点上可以产生两种稳定修饰:AEP（+163.0938 Da）和4D-AEP（+167.1189 Da）,根据肽段上增加的稳定修饰能够快速鉴别标记肽段和磷酸化位点。以大肠杆菌的KdpE和VicR两种反应调节蛋白作为实验对象,首先对通过乙酰磷酸酐（AcP）体外磷酸化实验所得的pKdpE和pVicR进行标记,对蛋白标记的实验条件进行优化。在优化后的标记条件下,成功在已知的pKdpE和pVicR的pAsp52位点上增加了 AEP修饰,并通过LC-MS/MS检测和蛋白组学分析进行鉴定和识别,建立了快速识别和鉴定蛋白中磷酸化天冬氨酸位点的蛋白组学方法。这一方法同样可以应用于磷酸化谷氨酸位点的发现。通过引入稳定同位素标记试剂4D-AEP,还可以实现进一步的羧基磷酸化蛋白的动态定量。综上所述,本文为特异性识别和广泛发现不稳定羧基磷酸化修饰及羧基磷酸化蛋白的生物功能的揭示提供了新方法。
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