由于农药的广泛使用,我国食品和农产品中的农药残留情况严重。有机磷类和氨基甲酸酯类农药是常用的广谱性杀虫剂,其作用机理是对昆虫乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase,AChE）活性中心丝氨酸产生磷酸化或氨基甲酰化。其残留在食品或农作物上的农药会引起人、畜中毒,危害健康,污染环境。酶抑制法作为广谱性检测有机磷和氨基甲酸酯类农药的方法,具有简便、快速和灵敏度高的优势。乙酰胆碱酯酶是酶抑制法的核心试剂,其活性、灵敏度、稳定性是评价其质量以及是否能应用于实际农药检测的重要指标。实验室前期获得了毕赤酵母表达的重组家蚕乙酰胆碱酯酶（recombinant Bombyx mori acetylcholinesterase,rBmAChE）,对有机磷及氨基甲酸酯两类农药敏感性强。为了进一步提高酶的性能,本研究从提高rBmAChE稳定性、活性和灵敏度三方面进行了研究,包括保护剂的筛选和酶制剂的制备、定点突变改造和作为结合伴侣的纳米抗体制备和筛选。主要实验结果如下:1保护剂筛选及rBmAChE酶制剂的制备与评价对毕赤酵母表达的rBmAChE表达上清进行Ni亲和层析,经过梯度洗脱确定洗脱的咪唑浓度为200 m M。比较分析了甘油、山梨醇、蔗糖、Na Cl、明胶和DMSO 6种保护剂在-20℃、4℃和25℃下对rBmAChE的保护效果,结果显示:明胶对酶具有明显的保护作用,4℃为酶的最适保存温度。进一步对明胶浓度进行优化筛选,确定5 g/L的明胶为酶的最适保护剂。添加保护剂后的液体酶制剂活性在储存30 d后保持100%。将添加保护剂的rBmAChE制备成冻干粉,在-80℃、-20℃、4℃和25℃下均能够显著提高rBmAChE的储存稳定性,保存30 d后酶活性依然保持在100%左右。2 rBmAChE的定点突变与分子进化利用Swiss-model在线服务器对rBmAChE进行同源建模,以果蝇AChE晶体结构为模板获得三个模型,进一步利用Lead IT分别将模型与底物碘代硫代乙酰胆碱（iodithioacetylcholine,ATCh I）和10种农药进行分子对接,通过拉氏图分析以及对接打分与农药IC50数据相关性分析,最终选取model1作为rBmAChE的最适模型,并且确定瓶颈位置Y398为重要氨基酸。在此基础上设计Y398定点突变（Y398G/F/W）。突变体经过拷贝数筛选和毕赤酵母分泌表达,结果显示,Y398G突变导致酶活性下降,对部分农药的灵敏度下降;Y398F使酶活性显著下降,而对农药的灵敏度提高2倍;Y398W则使酶活性显著提高,对农药灵敏度略有下降,但仍低于国标GB 2763-2019中的最大残留限量要求,符合检测需求。进一步研究Y398W突变体的酶促反应动力学发现,突变导致了底物亲和力下降,而最大催化效率Vmax显著提高。3 rBmAChE纳米抗体噬菌体展示文库的构建及淘筛以rBmAChE为抗原免疫双峰驼,分别采用一步法和两步法构建噬菌体展示纳米抗体文库。一步法构建得到文库库容量为4×10~8 cfu/m L的文库,多样性为100%。两步法构建得到文库容量4.15×10~8 cfu/m L,插入率为86%。经辅助噬菌体M13K07救援后分别获得约1013 pfu/m L和1012 pfu/m L的噬菌体展示纳米抗体库。对两个噬菌体展示库进行4轮淘筛,共获得99个阳性克隆,序列分析结果显示这些克隆属于44个家族。从中挑选48个序列各异的克隆作为rBmAChE的特异性纳米抗体。4纳米抗体对rBmAChE活性、稳定性的研究对48个抗rBmAChE的纳米抗体进行表达纯化,研究其对rBmAChE酶活性的影响。结果显示:其中15个纳米抗体对酶活性有抑制作用,6个有增强作用。以Thermofluor方法测定48个纳米抗体对rBmAChE稳定性的影响,发现rBmAChE的Tm（melting temperature）值为55.43±0.69℃,7个纳米抗体可以提高酶的Tm值至60℃以上,其中Nb4和Nb9同时为具有增强酶活性作用的增强子。这两个纳米抗体对酶促反应动力学的影响结果显示:Nb4同时提高rBmAChE的底物亲和力和最大催化速率,Nb9提高酶的底物亲和力而不改变最大催化速率。经过SPR测定两个抗体的亲和力常数KD值分别为18.4 n M和1.1μM。通过5 min和4 h的热加速实验分析发现,Nb4对rBmAChE在60℃、70℃时的稳定性保护作用显著,Nb9在45℃、50℃时保护效果较优。以等摩尔比添加两个纳米抗体能够使酶在-80℃下储存30 d,活性维持100%。同时以10倍摩尔比添加两个纳米抗体能够使酶在-20℃和4℃下储存30 d,活性维持100%,在25℃下储存30 d,活性维持62%。复合添加Nb4和Nb9的rBmAChE对部分农药的灵敏度有所下降,但其LOD依然满足农药检测需求。5分子突变及纳米抗体对rBmAChE性能影响的分子动力学研究以Gromacs对rBmAChE及其Y398G/F/W突变体预测结构进行分子动力学模拟,对底物ATCh I进行恒力拉伸动力学模拟,选取200 k J/M/min的恒力进行拉伸,分析认为瓶颈氨基酸的侧链位阻越大、极性越强（Y398W）越有利于固定带正电荷的小分子底物,因此表现出活性增强。选取400 k J/M/min的恒力对农药三羟基克百威进行拉伸动力学模拟,分析显示对于大分子如农药等,瓶颈氨基酸侧链过大或过小均不利于结合,适当的空间位阻以及增加侧链疏水性（Y398F）可以促进结合和推进,从而表现出灵敏度的提高。利用Codock PP在线服务器对Nb4和Nb9与rBmAChE进行对接,根据两个抗体对酶性能的影响选取对接位点,并进行动力学模拟。预测结果显示:Nb4结合于酶的活性中心口袋腔入口处,Nb9结合于酶C端的两个α螺旋处。推测Nb9通过稳定酶的外表面起到主要的保护作用,Nb4通过稳定活性中心口袋腔的空间结构起到保护作用。两个纳米抗体均能使rBmAChE的均方根涨落整体下降,与稳定性结果相符合。rBmAChE与Nb4或Nb9复合物的ATCh I分子对接表明,Nb4和Nb9都是通过提高对ATCh I的静电吸附作用,从而提高rBmAChE对底物的亲和力,最终使酶活性增强。