目的:1.通过体内外建立的NAFLD模型,观察利拉鲁肽对NAFLD模型的小鼠及HepG2细胞的肝细胞脂肪变、糖异生及炎症等方面的改善效应及对肝脏局部RAAS系统ACE/AngⅡ/AT1R轴和ACE2/A1-7/MAS轴表达的调控作用,探讨RAAS系统在利拉鲁肽改善NAFLD中所起的作用及机制。2.使用ACE2敲除的小鼠及外源性A1-7干预NAFLD模型的C57BL/6J小鼠分别下调及上调ACE2/Ang-（1-7）/MAS轴以进一步证明ACE2/Ang-（1-7）/MAS轴在NAFLD中所直接扮演的角色。方法:1.选用15只6周龄雄性C57BL/6J小鼠,长期高脂饮食加小剂量链脲佐菌素（STZ）腹腔注射诱导T2DM非酒精性脂肪肝模型。造模成功后随机分为T2DM模型组（T2DM组）（n=5）,利拉鲁肽干预组（n=5）（利拉鲁肽组）和Ang-（1-7）干预组（A1-7组）（n=5）。另选取5只正常的雄性C57BL/6J小鼠持续普通饲料喂养作为正常对照组（NC组）（n=5）。药物干预组均持续给药4周。实验结束后,肝脏组织HE染色和油红O染色及TG含量测定检测肝脏的脂肪变情况;RT-PCR检测肝脏CPT-1a、ACOX-1、G6P、PEPCK、NFκB和IL-1β的mRNA表达水平。2.NC组,T2DM模型组及利拉鲁肽组采用RT-PCR方法检测肝脏RAAS系统组分ACE、AT1R、ACE2、MAS的mRNA表达水平。3.ACE2基因敲除（ACE2 KO）和野生型（WT）小鼠各选取3只,均持续给予普通饲料喂养,肝脏组织HE染色和油红O染色及TG含量测定观察肝脏的脂肪变情况;RT-PCR检测肝脏CPT-1a、ACOX-1、G6P、PEPCK、NFκB和IL-1β的mRNA表达水平。4.0.25mM浓度的棕榈酸（PA）干预HepG2细胞诱导肝细胞脂肪变,建立体外NAFLD模型。为了检测在体外NAFLD条件下利拉鲁肽对HepG2细胞RAAS组分基因表达的影响及信号通路PI3K/AKT在其中所起的作用,我们将细胞分为正常对照组（C组）、0.25mM PA组（PA组）、PA+利拉鲁肽（10 nmol/L）组（利拉鲁肽组）、PA+利拉鲁肽（10 nmol/L）+PI3K抑制剂LY294002（20umol/L）组（LY294002组）。干预24小时后,Western blot检测各组细胞AKT、P-AKT蛋白的表达,RT-PCR检测各组细胞RAAS系统组分ACE、AT1R、ACE2、MAS的mRNA表达。5.为了检测ACE2/A1-7/MAS轴在利拉鲁肽介导的改善NAFLD效应中所扮演的角色,我们使用MAS受体特异性拮抗剂A779,检测阻断ACE2/A1-7/MAS轴对利拉鲁肽效应的影响。0.25mM浓度的棕榈酸（PA）干预HepG2细胞诱导肝细胞脂肪变,建立体外NAFLD模型。这部分实验将细胞分为正常对照组（C组）、0.25mM PA组（PA组）、PA+利拉鲁肽（10 nmol/L）组（利拉鲁肽组）、PA+Ang-（1-7）(10^-7mol/L)组（A1-7组）、PA+利拉鲁肽（10 nmol/L）+Ang-（1-7）(10^-7mol/L)组（利拉鲁肽+A1-7联合组）、PA+利拉鲁肽（10 nmol/L）+A779(10^-7mol/L)组（利拉鲁肽+A779组）。干预24小时后,检测各组细胞中甘油三酯（TG）的含量;RT-PCR检测CPT-1a、ACOX-1、G6P、PEPCK、NFκB和IL-1β的mRNA表达;细胞免疫荧光法检测NFκBp65因子的核转位;Western blot检测AMPK、P-AMPK蛋白的表达。6.所有的实验数据采用SPSS11.5统计学软件进行分析,以均数±标准差表示,两组间均数比较采用t检验,多组间均数比较采用单因素方差分析（one-wayANOVA）;P<0.05代表有统计学差异。结果:实验结束后,1.肝脏HE油红O染色结果显示:T2DM组肝脏组织学结构紊乱,肝细胞出现明显的脂肪沉积,肝细胞内红色脂滴明显增多,利拉鲁肽组肝脏组织学结构及脂肪变明显得到改善,红色脂滴明显减少;TG含量检测结果显示:T2DM组肝脏TG含量显著高于NC组（P<0.01）,利拉鲁肽组肝脏TG含量显著低于T2DM组（P<0.01）;RT-PCR结果显示:和NC组相比,T2DM组肝脏脂肪酸β氧化相关基因CPT-1a、ACOX-1的mRNA表达降低（分别P<0.01和P<0.05）,糖异生的关键酶G6P、PEPCK的mRNA表达升高（均P<0.01）,炎症信号NFκB及IL-1βmRNA表达也升高（均P<0.01）。和T2DM组相比,利拉鲁肽组CPT-1a、ACOX-1的mRNA表达明显升高（分别P<0.01和P<0.05）,G6P、PEPCK的mRNA表达明显降低（均P<0.01）,NFκB及IL-1β的mRNA表达明显降低（均P<0.01）。2.RT-PCR结果显示:T2DM组肝脏ACE、AT1R、ACE2、MAS的mRNA表达均显著高于NC组（分别P<0.01、P<0.05、P<0.01、P<0.05）,而利拉鲁肽组和T2DM组相比,肝脏ACE、AT1R的mRNA表达明显降低（均P<0.01）,而ACE2、MAS的mRNA表达则进一步升高（均P<0.05）。3.肝脏HE及油红O染色结果显示:ACE2 KO组和WT组相比,肝脏组织学结构紊乱,肝细胞出现明显的脂质沉积,肝细胞内红色脂滴明显增多;TG含量检测结果显示:ACE2 KO组肝脏TG含量显著高于WT组（P<0.01）;RT-PCR结果显示:和WT组相比,ACE2 KO组肝脏脂肪酸β氧化相关基因CPT-1a、ACOX-1的mRNA表达降低（分别P<0.01和P<0.05）,而糖异生的关键酶G6P、PEPCK的mRNA表达升高（均P<0.01）,炎症信号NFκB及IL-1βmRNA表达升高（均P<0.01）。而外源性A1-7干预T2DM模型C57BL/6J小鼠4w后,和T2DM组相比,A1-7组小鼠肝脏HE及油红O染色结果显示肝脏脂肪变情况明显得到改善;TG含量检测显示肝脏组织TG含量明显降低（P<0.05）;RT-PCR结果显示:和T2DM组相比,A1-7组肝脏CPT-1a、ACOX-1的mRNA表达升高（分别P<0.01和P<0.05）,G6P、PEPCK的mRNA表达降低（均P<0.05）,NFκB及IL-1βmRNA表达降低（均P<0.01）。4.体外实验结果表明:与C组相比,PA组肝细胞内P-AKT蛋白水平降低,ACE、AT1R、ACE2、MAS的mRNA表达均升高（分别P<0.01、P<0.01、P<0.05、P<0.01）。与PA组相比,利拉鲁肽组P-AKT蛋白水平升高,ACE、AT1R的mRNA表达降低（分别P<0.05和P<0.01）而ACE2、MAS的mRNA表达则进一步升高（分别P<0.05和P<0.01）。与利拉鲁肽组相比,LY组P-AKT蛋白水平降低,ACE、AT1R的mRNA表达升高（分别P<0.05和P<0.01）而ACE2、MAS的mRNA表达则降低（分别P<0.05和P<0.01）。4组细胞总AKT蛋白表达均无统计学差异。5.体外实验结果表明:与C组相比,PA组肝细胞内TG含量升高（P<0.01）;CPT-1a、ACOX-1的mRNA表达降低（均P<0.01）,G6P、PEPCK的mRNA表达升高（均P<0.01）,NFκB及IL-1βmRNA表达升高（均P<0.01）;P-AMPK蛋白表达明显降低;NFκB p65出现了明显的核转位。与PA组相比,利拉鲁肽组和A1-7组两组肝细胞内TG含量降低（均P<0.01）;CPT-1a（分别P<0.05和P<0.01）、ACOX-1（均P<0.01）的mRNA表达升高,G6P（均P<0.01）、PEPCK（均P<0.01）的mRNA表达降低,NFκB（分别P<0.01和P<0.05）及IL-1β（均P<0.01）mRNA表达降低;P-AMPK蛋白表达明显升高;NFκB p65的核转位明显受到抑制。与利拉鲁肽组及A1-7组两个单独用药组相比,利拉鲁肽和A1-7联合组肝细胞内TG含量进一步降低（分别P<0.05和P<0.01）;CPT-1a（均P<0.05）、ACOX-1（分别P<0.05和P<0.01）的mRNA表达进一步升高,G6P（均P<0.05）、PEPCK（分别P<0.01和P<0.05）的mRNA表达进一步降低,NFκB（分别P<0.01和P<0.05）及IL-1β（分别P<0.05和P<0.01）mRNA表达进一步降低。而P-AMPK蛋白表达水平与两个单独用药组相比无明显差异。与利拉鲁肽组相比,利拉鲁肽+A779组肝细胞内TG含量升高（P<0.01）;CPT-1a、ACOX-1的mRNA表达降低（均P<0.05）,G6P、PEPCK的mRNA表达升高（均P<0.01）,NFκB及IL-1βmRNA表达升高（均P<0.05）;P-AMPK蛋白表达降低;NFκBp65又出现了明显的核转位。6组细胞总AMPK蛋白表达水平均无统计学差异。结论:1.利拉鲁肽可以有效改善T2DM模型小鼠及PA诱导的HepG2细胞的NAFLD,包括对肝脏脂肪酸β氧化相关基因表达的改善,对肝脏糖异生及炎症信号相关基因表达的抑制。2.在体内外NAFLD模型条件下,肝脏局部及HepG2细胞内RAAS系统是过度激活的,表现为ACE、AT1R、ACE2、MAS的mRNA表达的上调,并且利拉鲁肽可以明显下调ACE、AT1R的mRNA表达水平及进一步上调ACE2、MAS的mRNA表达水平,表明了利拉鲁肽对肝脏局部RAAS系统两条轴的双重调控效应。并且体外使用MAS特异性拮抗剂A779阻断ACE2/A1-7/MAS轴可以明显减弱甚至阻断利拉鲁肽介导的对于NAFLD的改善效应,包括利拉鲁肽对于脂肪酸氧化的增强,对于糖异生及炎症的抑制。表明了利拉鲁肽对于NAFLD的改善效应至少部分依赖于其对肝脏局部ACE2/A1-7/MAS轴的上调作用。3.利拉鲁肽对于RAAS系统ACE/AngⅡ/AT1R轴及ACE2/A1-7/MAS轴表达的调控效应至少部分是由PI3K/AKT信号的激活所介导。4.ACE2敲除小鼠表现为明显的NAFLD的表型,表现为肝脏脂肪酸氧化的受损,糖异生的增强及炎症信号的激活。而使用外源性A1-7干预T2DM模型C57BL/6J小鼠可以明显的改善NAFLD,包括对肝脏脂肪酸β氧化的增强,对肝脏糖异生及炎症的抑制。表明了抑制ACE2/A1-7/MAS轴的活性可以促进NAFLD的形成,而激活ACE2/A1-7/MAS轴却可以发挥对NAFLD的治疗效应。揭示了ACE2/A1-7/MAS轴可能作为NAFLD治疗的一个潜在的靶点。