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茶树(Camellia sinensis)是多年生常绿木本植物,是当前我国重要经济作物之,茶叶产业的发展对我国社会经济的发展具有重要作用。茶树的生长对温度有定的要求,喜较温暖的气候条件,通常在10-35℃范围内都能正常生长。低温、冻害对茶树的生长发育有严重影响,当温度降至在8℃以下,根系停止活动,低于茶树所能忍受的限度时,冻害就会发生。CBF转录因子是AP2/ERF基因家族中ERF亚家族的一个成员,在植物对抗低温胁迫时起重要作用。利用RT-PCRRACE技术,获得了一个茶树冷诱导CBF基因的cDNA片段,命名为Cs-COR041(GenBank登录号FE942095)。根据该Cs-COR041序列设计CsCBF3基因特异性引物,以SMART cDNA文库为模板,克隆出其3’末端,长约450bp,5’末端长约600bp。将已知的cDNA序列与所得的5’端及3’端序列拼接得到1162bp的CsCBF3基因全长((JenBank登录号KC702795)。该序列包含一个完整的开放阅读框ORF,长720bp,编码一个由239个氨基酸残基组成的多肽链,其核苷酸编码蛋白质理论分子量为26.44kDa,等电点pI5.22。然后对CsCBF3基因进行了系统进化分析,结果显示茶树CsCBF3基因与杨树、葡萄具有较近亲缘关系：氨基酸序列比对分析结果显示CsCBF3含有保守的AP2结合域；各物种CBF基因编码的AP2结构域隐马模型图显示CsCBF3的AP2结构域高度保守,只有个别的序列发生变化。通过酵母单杂交试验对CsCBF3基因的转录活性进行了分析,结果表明CsCBF3蛋白具有转录激活活性,能与DRF/CRT元件特异性结合,进一步研究发现,CsCBF3蛋白激活区之外的其他区域对其激活功能有抑制作用。将CsCBFl和CsCBF3基因构建到经改造的植物表达载体pCABIA1300S载体上,该植物表达载体具有一个35S强驱动启动子,具有Hygromycin抗性筛选标记。成功构建了CsCBF1-pCABIA1300S和CsCBF3-pCABIA1300S烟草表达载体,采用农杆菌介导的方法转化烟草,用潮霉素进行筛选。采用PCR方法对再生植株进行转基因鉴定,分别获得23株CsCBF1和18株CsCBF3的T0代转基因烟草。构建了pCznl-CBF1和pCzn1-CBF3蛋白表达载体,将重组质粒转入大肠杆菌Arctic Express中。用IPTG诱导,重组蛋白以包涵体形式存在。分离包涵体,经过蛋白的变性与复性,用Ni柱亲和层析,得到了CBF1和CBF3重组蛋白。