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目的:糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)即糖尿病肾小球硬化症,是糖尿病最常见、最严重的慢性微血管并发症之一,也是糖尿病患者致残与死亡的重要原因。DN的主要病理学特征为:早期肾小球肥大,肾小球基底膜增厚,肾小球系膜区扩张;晚期细胞外基质(ECM)进行性积聚,导致肾小球硬化、肾小管间质的纤维化。DN的发病机制可概括为血液动力学和代谢紊乱相互作用的结果,其中贯穿多条信号转导通路的激活及相关细胞因子的表达,且各种因素相互关联,形成一个复杂的病理生理学网络系统。目前DN的防治尚缺乏针对性较强的特效手段,而中医中药以其多靶点的整体调节和以人为本的个性化治疗方案,在临床防治DN中具有很大的潜力。在临床实践中,我们根据中医学的病因病机理论,并结合DN的临床表现、发病机制及其病理特点,逐步认识到DN的主要病机为气阴两虚而致血瘀,血瘀日久不愈而深伏于络,渐成微小癥积而致本病。本实验所采用的益气养阴消癥通络中药正是基于以上对DN病因病机的分析而拟定的,用之临床疗效确切,而且前期的临床和实验研究证明本方具有保护肾功能及延缓肾小球硬化的作用,本研究试图以氧化应激和p38MAPK信号转导通路系统为切入点,旨在从整体和细胞两个研究水平进一步探索本方对DN发生发展的影响及其可能作用机制。方法:1益气养阴消癥通络中药对糖尿病大鼠肾脏的保护作用SD大鼠110只,雄性,SPF级,体重250±20g,适应性饲养一周后,分别测定尿蛋白阴性后行左肾摘除术。2周后大鼠随机分为单纯肾切组和造模组,造模组大鼠腹腔注射STZ(40 mg·kg-1·d-1)一次,72 h后连续3次测血糖≥16.7 mmol·L-1为糖尿病大鼠。造模组大鼠随机分为模型组、厄贝沙坦组、中药低、中、高剂量组。厄贝沙坦组大鼠给予厄贝沙坦15 mg·kg-1·d-1灌胃,中药低、中、高剂量组大鼠分别给予中药5.29 g·kg-1·d-1、10.58 g·kg-1·d-1、21.16 g·kg-1·d-1灌胃,余组给予等剂量生理盐水灌胃,每日给药一次,连续6周。于给药第6周末,收集24 h尿液,股动脉采血,处死大鼠,分离皮髓质,检测各组大鼠24 h尿蛋白定量,光镜下观察各组大鼠肾脏的病理改变,及应用RT-PCR方法检测各组大鼠肾皮质IV型胶原(α1链)的mRNA表达水平。2益气养阴消癥通络中药对糖尿病大鼠肾脏氧化应激的影响动物模型的建立、给药方法同上,于给药第6周末,留取肾皮质组织标本,应用MDA、SOD检测试剂盒对各组大鼠肾皮质中MDA含量和SOD活力进行测定。3益气养阴消癥通络中药对糖尿病大鼠肾脏p38MAPK信号转导通路的影响动物模型的建立、给药方法同上,于给药第6周末,留取肾皮质组织标本,采用RT-PCR方法检测各组大鼠肾皮质p38MAPK mRNA表达水平,采用western blot方法检测各组大鼠肾皮质p38MAPK、p-p38MAPK、STAT3、p-STAT3的蛋白表达水平。4益气养阴消癥通络中药血清对高糖联合AngII培养的大鼠系膜细胞p38MAPK信号转导通路的影响4.1大鼠肾小球系膜细胞(MCs)的培养及鉴定采用原代培养方法进行MCs培养,经形态学、免疫组织化学鉴定培养细胞为MCs,取亚培养的第5~7代细胞用于实验。4.2药物血清制备SD大鼠12只随机分为3组,即中药血清组、厄贝沙坦血清组、正常大鼠血清组,每组4只。中药血清组和厄贝沙坦血清组大鼠每日以成人剂量/kg的15倍,分2次灌服相应药物,每次3mL,连续3天,并于末次给药1小时后,股动脉无菌取血,分离血清,56℃水浴箱中30分钟灭活,过滤除菌,-20℃冰箱保存备用。正常血清组大鼠每日灌服同等剂量的生理盐水,采血和分离血清方法同前。4.3实验分组及指标检测采用MTT法筛选中药血清浓度后,分组并进行相应药物干预:低糖对照组(D-葡萄糖浓度5.5mmol·L-1+5%正常大鼠血清)、高糖组(D-葡萄糖浓度25mmol·L-1+5%正常大鼠血清)、高糖+AngII组(D-葡萄糖浓度25mmol·L-1+AngII 10-6mol·L-1+5%正常大鼠血清)、厄贝沙坦血清组(D-葡萄糖浓度25mmol·L-1+AngII 10-6mol·L-1+5%厄贝沙坦血清)、中药血清组(D-葡萄糖浓度25mmol·L-1+AngII 10-6mol·L-1+5%中药血清),各组均加入含有胎牛血清的RPMI-1640培养液,使血清终浓度为10%。各组MCs培养48h后,应用ELISA试剂盒测定细胞上清的Col-IV含量,采用western blot方法检测各组MCs总蛋白中p38MAPK、p-p38MAPK、STAT3、p-STAT3的蛋白表达水平。结果:1益气养阴消癥通络中药对糖尿病大鼠肾脏的保护作用1.1各组大鼠24h尿蛋白定量(U Pro)的比较与单纯肾切组比较:模型组、各治疗组U Pro均升高(P<0.05);与模型组比较:厄贝沙坦、中药低、中剂量组U Pro均下降(P<0.05),中药高剂量组U Pro无统计学意义(P>0.05),厄贝沙坦、中药低、中剂量组之间无统计学意义(P>0.05)。1.2各组大鼠肾脏病理形态学观察光镜观察:单纯肾切组大鼠肾脏肾小球未见明显肥大,毛细血管基底膜无增厚,系膜细胞数量与系膜基质分布面积大小正常,肾小管间质无明显病理改变。模型组大鼠肾脏肾小球明显肥大,毛细血管基底膜增厚,系膜区增宽,肾小管上皮细胞空泡变性或颗粒变性。厄贝沙坦、中药各剂量组以上病理改变较模型组为轻,各治疗组间差异不明显。1.3肾皮质Col-IV(α1)mRNA表达比较与单纯肾切组比较:模型组、各治疗组Col-IV(α1)mRNA表达均增加(P<0.01、P<0.05)。与模型组比较:厄贝沙坦、中药低剂量组Col-IV(α1)mRNA表达均减少(P<0.01、P<0.05),两组之间无统计学意义(P>0.05),余治疗组Col-IV(α1)mRNA表达无统计学意义(P>0.05)。2益气养阴消癥通络中药对糖尿病大鼠肾脏氧化应激的影响与单纯肾切组比较:模型组、各治疗组MDA含量均升高、T-SOD活性均下降(P<0.05);与模型组比较:厄贝沙坦、中药低、中剂量组MDA含量均下降、T-SOD活性均升高(P<0.05),中药高剂量组两项指标均无统计学意义(P>0.05);厄贝沙坦、中药低、中剂量组之间两项指标均无统计学意义(P>0.05)。3益气养阴消癥通络中药对糖尿病大鼠肾脏p38MAPK信号通路的影响3.1肾皮质p38 MAPK mRNA表达比较与单纯肾切组比较:模型组、各治疗组p38 MAPK mRNA表达均增加(P<0.01、P<0.05)。与模型组比较:各治疗组p38 MAPK mRNA表达均减少(P<0.05),且中药低剂量组效果为优(P<0.05),余治疗组之间p38 MAPK mRNA表达无统计学意义(P>0.05)。3.2肾皮质p-p38 MAPK、p38 MAPK、p-STAT3、STAT3蛋白表达比较与单纯肾切组比较:模型组、各治疗组p-p38 MAPK、p-STAT3蛋白表达均均增加(P<0.01);与模型组比较:厄贝沙坦、中药低、中剂量组p-p38 MAPK、p-STAT3蛋白表达均减少(P<0.01或P<0.05),中药高剂量组以上两种蛋白表达无统计学意义(P>0.05);各组p38 MAPK、STAT3蛋白表达均无统计学意义(P>0.05)。4益气养阴消癥通络中药血清对高糖联合AngII培养的大鼠系膜细胞p38MAPK信号转导通路的影响4.1益气养阴消癥通络中药血清对MCs培养上清Col-IV蛋白含量的影响与低糖对照组比较,余组Col-IV蛋白含量均明显升高(P<0.01);与高糖组比较,高糖+AngII组Col-IV蛋白含量明显升高(P<0.01);与高糖组+AngII组比较,厄贝沙坦血清、中药血清组Col-IV蛋白含量均明显下降(P<0.01);两药物血清组之间比较无统计学意义(P>0.05)。4.2益气养阴消癥通络中药血清对MCs p-p38MAPK、p38MAPK、p-STAT3、STAT3蛋白表达的影响与低糖对照组比较,余组p-p38MAPK、p-STAT3蛋白表达均明显升高(P<0.01);与高糖组比较,高糖+AngII组p-p38MAPK、p-STAT3蛋白表达均明显升高(P<0.01);与高糖+AngII组比较,厄贝沙坦血清、中药血清组p-p38MAPK、p-STAT3蛋白表达均明显下降(P<0.01);两药物血清组之间p-p38MAPK、p-STAT3蛋白表达无统计学意义(P>0.05);各组p38MAPK、STAT3蛋白表达均无统计学意义(P>0.05)。结论:1.益气养阴消癥通络中药能够显著减少糖尿病大鼠尿蛋白的排泄,减轻肾脏病理损害,并能下调IV型胶原(α1链)的基因表达,从而延缓了DN的发生发展。2.益气养阴消癥通络中药能够抵抗糖尿病大鼠肾脏氧化应激反应,抑制p38MAPK/STAT3信号转导通路的活化,这可能是其发挥肾脏保护作用的机制之一。3.益气养阴消癥通络中药低、中剂量治疗效果优于高剂量,提示此中药短期干预DN无浓度依赖性。4.益气养阴消癥通络中药血清能够抑制MCs p38 MAPK/STAT3信号转导通路的激活,下调Col-IV蛋白表达,最终减少了细胞外基质的积聚,这一结果与本实验中整体研究结果一致,从而从细胞生物学上对益气养阴消癥通络中药治疗DN的可能作用机制予以了佐证。