【摘 要】
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蛋白质是水稻中仅次于淀粉的第二大类营养物质,其中谷蛋白的含量最高,其含量和组成会直接影响稻米的营养品质。本研究利用CRISPR/Cas9系统对水稻谷蛋白基因Glu A3(LOC_Os03g31360/Os03g0427300)进行编辑,致力于改良稻米品质和培育功能性稻米。通过构建双靶点敲除载体、质粒转染、农杆菌介导转化和植物组织培养技术等方法得到成功编辑植株后,对T_3代突变体进行基因检测、农艺性
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蛋白质是水稻中仅次于淀粉的第二大类营养物质,其中谷蛋白的含量最高,其含量和组成会直接影响稻米的营养品质。本研究利用CRISPR/Cas9系统对水稻谷蛋白基因Glu A3(LOC_Os03g31360/Os03g0427300)进行编辑,致力于改良稻米品质和培育功能性稻米。通过构建双靶点敲除载体、质粒转染、农杆菌介导转化和植物组织培养技术等方法得到成功编辑植株后,对T3代突变体进行基因检测、农艺性状观察、转录水平和蛋白翻译水平检测分析等研究,得到以下研究成果:(1)本研究利用CRISPR/Cas9系统成功地对水稻谷蛋白基因Glu A3进行编辑,获得了27种纯合突变类型编辑植株,突变类型涉及单个碱基的缺失、插入、替换及大片段缺失和插入,由于基因突变导致蛋白翻译提前终止,蛋白质的结构域缺失、空间结构简单化,后续选择11种纯合突变类型的植株(“嘉花1号”突变体:m1-m6,“益肾稻1号”突变体:m7-m11)进行检测分析。(2)对突变体m1-m11进行转录水平分析,与野生型相比,突变体Glu A3基因表达水平下调,Glu B4和Glu B5表达量上调,“嘉花1号”突变体的Glu C基因表达上调,而Glu A1、Glu A2和Glu D基因表达量无明显变化;“益肾稻1号”突变体的Glu C基因表达量无明显变化,其他谷蛋白基因表达下调。(3)对突变体m1-m11进行农艺性状调查,发现其在株高、分蘖数、穗长、结实率和千粒重等农艺性状方面,与野生型相比存在显著差异。(4)利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)方法检测蛋白质含量变化,经过分析发现突变体m4-m6的谷蛋白和总蛋白含量与“嘉花1号”相比略有增加,突变体m9-m11的谷蛋白含量与“益肾稻1号”相比微有降低。此外,利用近红外谷物分析仪检测蛋白质含量变化,经过检测发现突变体m1、m2、m7和m9-m11的总蛋白含量下降,m3-m6和m8的总蛋白含量上升。本研究获得了谷蛋白和总蛋白含量降低的稻米,这可为培育适用于慢性肾脏病患者食用的功能性水稻提供材料;同时,也获得了谷蛋白和总蛋白含量升高的稻米,这可为稻米品质改良提供材料。此外,对于CRISPR/Cas9系统编辑水稻其他谷蛋白基因提供研究方向和理论基础。
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