研究背景:胃黏膜肠上皮化生(Gastric intestinal metaplasia,GIM)是由包括潘氏细胞、杯状细胞和吸收细胞组成的肠黏膜取代了正常的胃黏膜上皮细胞的一种疾病。它是胃癌(gastric cancer,GC)发生路径中的一重要癌前病变,研究表明胃黏膜菌群、口腔菌群均是胃癌发生的潜在风险因素,胃肠上皮化生作为一种癌前病变,菌群在其中发挥的作用,研究较少,尤其是口腔菌群和十二指肠菌群,未见相关报道。本实验旨在研究胃黏膜肠上皮化生患者胃、十二指肠和口腔的菌群分布情况,分析研究胃黏膜肠上皮化生的胃、十二指肠和口腔菌群菌群种类、构成及特点,探讨十二指肠和口腔菌群在胃肠上皮化生发生发展过程中的可能机制。第一部分胃肠化生患者胃与十二指肠菌群分析研究方法:2014～2015年在山东大学齐鲁医院内镜中心行胃镜检查的患者,从中收集符合研究标准的10例胃黏膜肠上皮化生患者以及10例胃镜检查有轻度胃炎的人群作为对照组进行研究。胃镜下采集受试者胃黏膜肠上皮化生部位及十二指肠部位黏膜,对照组采集其胃黏膜及十二指肠黏膜,应用高通量测序技术,对患者及对照组黏膜菌群进行16S rRNA测序。并利用LEfSe,SPSS等软件对肠道菌群差异进行分析比对。研究结果:本研究共招募20名受试者,包括10名胃肠化生患者(6名男性,4名女性,6名HP 阳性)和10名健康对照者(5名男性,5名女性,4名HP 阳性)。卡方检验结果两组间男女性别比例没有统计学差异(男性:60.0%Vs50.0%,P=0.65)。胃肠化生患者组平均年龄和对照组相比没有统计学差异(51.3±8.01Vs57.80±7.22,P=0.07)。10位胃肠化生患者和10位健康对照的胃黏膜和十二指肠黏膜菌群经测序,然后去除不合格序列,共计得到148.66万条序列,片段平均长度为447bp,样本测序数在2.83-4.48万条。对样本进行抽平后每个样本的序列数为2.77万条,进行后续分析。在此基础上,我们比较了肠化生患者和健康对照胃黏膜和十二指肠黏膜菌群的α多样性,结果表明健康对照和肠化生患者十二指肠黏膜菌群Shannon指数均高于肠化生患者胃黏膜菌群(2.49±0.06 vs 2.31±0.09,P<0.01;2.40±0.03 vs 2.31±0.09,P<0.01)。健康对照的十二指肠黏膜菌群Shannon指数高于肠化患者十二指肠黏膜菌群(2.49±0.06 vs 2.40±0.03,P<0.01)。健康对照组的胃黏膜和十二指肠黏膜菌群没有统计学差异(P>0.05)。同时健康对照组的十二指肠菌群Simpson指数显著低于肠化生患者胃黏膜(0.14±0.01 vs 0.18±0.02,P<0.001)和十二指肠黏膜菌群(0.14±0.01 vs0.17±0.01,P<0.001)。此外,健康对照和肠化生患者胃黏膜和十二指肠黏膜菌群在sobs,Chao和Ace指数方面没有显著差异(P>0.05)。然后我们利用PCoA分析样本的菌群结构。结果发现对于十二指肠菌群,两组样本聚成两簇,进一步的ANOSIM分析表明,两组之间差异显著(ANOSIM,R=l,P=0.001)。同时我们发现胃黏膜感染HP并未影响十二指肠菌群结构。对于肠黏膜菌群,我们发现HP感染可以引起胃黏膜菌群结构的显著改变,HP阴性的肠化生患者胃黏膜菌群结构与HP阴性的健康对照也有显著差异(ANOSIM,R=0.452,P=0.042),同时,HP 阳性的肠化生患者胃黏膜菌群结构与HP阴性的健康对照胃黏膜之间也有显著差异(ANOSIM,R=0.548,P=0.003)。此外,分析结果表明肠化生患者的十二指肠黏膜菌群与HP阴性的肠化生患者胃黏膜菌群相似(ANOSIM,R=0.37,P=0.05),同时,健康对照的十二指肠黏膜菌群与HP阴性健康对照胃黏膜菌群结构相似(ANOSIM,R=0.176,P=0.075)。接下来我们分析了肠化生组和对照组的黏膜菌群组成。首先,对两组样本包含的OTU数目进行分析,结果表明所有样品中共计有125个OTU,其中四组共有的OTU有122个,说明各组具有较为一致的菌群组成。对各OTU进行聚类后分析发现,在门水平,胃黏膜和十二指肠黏膜菌群均主要由三个门构成,包括厚壁菌门,变形菌门和放线菌门。属水平的菌群组成发现乳球菌,芽孢杆菌,Helicobacter,Solibacillus,假单胞菌属,Arthobacter,Lysinibacillus,链球菌,Camobacterium为胃黏膜和十二指肠黏膜菌群主要包含的微生物属。我们对不同组间黏膜菌群进行了进一步比对分析,发现在门水平上,变形菌门(P<0.05)和放线菌门(P<0.01)在组间具有显著差异。而在属水平上乳球菌(P<0.01)、芽孢杆菌(P<0.001),Solibacillus(P<0.01),假单胞菌属(P<0.05)、Lysinibacillus 001),Carnobacterium(P<0.05),Exiguobacterium(P<0.01),Psychrobacter(P<0.05)和 Leuconostoc(P<0.05)属的微生物在4组中具有显著差异。通过以上分析发现,肠化生患者胃和十二指肠黏膜菌群与健康对照在菌群组成方面存在明显的差别,进而我们通过LEfSe技术对黏膜菌群的组成差异进行了比较,结果发现肠化生患者十二指肠黏膜组中Flavobacterium,Enhydrobacter,Psychrobacter和Streptococcus属的微生物显著增加(LDA>3.0);肠化生组胃黏膜中变形菌门的微生物增加;健康对照组肠黏膜中芽孢杆菌属,Oceanobacillus,Solibacillus,Exiguobacterium 等属微生物显著增加(LDA 大于 3)。在此基础上,我们进一步分析了肠化生患者和健康对照组内胃黏膜和十二指肠黏膜菌群差异。肠化生患者十二指肠黏膜与胃黏膜相比,芽孢杆菌,Solibacillus,Arthobacter,假单胞菌属、Streptococcus,Lysinibacillus,Epilithonimonas,Psychrobacter,Sporosarcina,Exiguobacterium,Brochothrix,Paenibacterium,Flavobacterium,Lactobacillus,Enhydrobacter和 Acinetobacter属微生物显著增多,而肠化患者胃黏膜中Epsilonproteobacteria纲和Campylobacterales目的微生物显著增加。与此同时,我们发现健康对照的胃黏膜菌群与十二指肠菌群差异微生物远少于肠化生患者,其中,十二指肠的菌群中Variovorax,Acinetobacter,Oceanobacillus属的微生物较多,与此同时,胃黏膜中变形菌门和norank_f Aerococcaceae属的微生物更为富集。此外,我们还单独分析了肠化生患者和健康对照的十二指肠菌群差异,我们可以看出肠化生患者与健康对照的十二指肠菌群差异较为显著,其中,肠化生患者十二指肠黏膜中 Lactococcus,Flavobacterium,Myroides,Enhydrobacter,Leuconostoc属微生物增多,而健康对照十二指肠菌群中富集的微生物包括Bacillus,Solibacillus,Lysinibacillus,Exiguobacterium,Oceanobacillus,Paenibacillus属微生物显著增多。我们还分析了肠化患者与健康对照胃黏膜菌群的差异,结果表明两组之间没有差异微生物,说明胃黏膜菌群改变不明显。第二部分胃肠上皮化生患者口腔菌群研究研究方法:选择2018年期间在山东大学齐鲁医院行胃镜检查的患者,受研究者包括符合入组标准的24例肠上皮化生患者以及24名健康查体且经胃镜检查发现没有明显胃炎、牙周病变、代谢、心血管或脑血管疾病或癌症的患者,后者作为对照组,并纳入排除标准。采集受试者的口腔拭子,利用高通量测序技术,对肠上皮化生患者及健康对照组的黏膜菌群进行16S rRNA测序。根据测序结果利用LEfSe,SPSS等软件对肠道菌群差异进行分析对比。研究结果:本研究共计纳入健康对照24人,其中男性13,女性11人,纳入24名胃肠化生患者,其中男性患者16人,女性患者8人。根据卡方检验,胃肠化生组与对照组之间男女性别比例没有显著差异(两组男性比:66.67%Vs54.17%,P=0.38)。胃肠化生患者组平均年龄为49.63±8.29,健康对照平均年龄为53.92±8.59,相比没有统计学差异(P>0.05)。通过对16S核糖体RNA基因v3-v4高变区的分析,对口腔样本进行了微生物多样性和丰富度的测定,以评估与胃肠化生患者口腔菌群是否具有显著改变。测序共获得2,367,977个高质量序列。所有样本的覆盖率估计均大于99.9%。在out数归一化后,每个样本获得39,368个序列,共计获得788个OTU。然后,我们计算了 ACE、Chao、Shannon和Simpson指数用于评估口腔菌群的a-多样性。其中ACE指数和Chao指数来评估OTU的丰富度,而Shannon指数和Simpson指数则用来评估OTU的多样性,结果表明:与健康对照相比,胃肠化生患者口腔的菌群丰富度略有增加,但两组间菌群的chao和ace指数无统计学差异。此外,尽管两组口腔菌群的shannon指数没有显著差异,胃肠化生口腔菌群的Simpson指数显著高于健康对照组(P<0.05),说明其菌群多样性低于健康对照组。在分析了菌群α多样性之后,我们利用基于bray curtis和weighted_unifrac距离,利用PCoA比较了两组的菌群结构,结果表明胃肠化生患者口腔菌群结构与对照有差异,再通过Anosim方法分析菌群结构差异,结果发现这两组间菌群的差异具有统计学意义(bray curtis,R=0.07,P=0.01;weighted_unifrac,R=0.06,P=0.02)。此后,我们再分析和比较胃肠化生患者和健康对照的口腔菌群组成。结果表明厚壁菌门、变形菌门和拟杆菌们占到口腔菌群的一半以上,但各菌门在不同个体之间差异极大,如,厚壁菌门在不同个体之间所占比例从20%-60%。胃肠化生患者与健康对照之间趋势相同。同样,在属水平也是相似的规律,个体间差异较大。进一步的,我们比较了两组间OTU的差异,结果表明两组共有的OTU数为523个,此外,健康对照组口腔菌群中独有的OTU有55个,而胃肠化生患者口腔菌群中独有的OTU为210个,说明胃肠化生患者口腔菌群物种更为丰富。我们下一步比较了两组在门和属水平上物种的差异。从LEfSe分析结果可以看出,胃肠化生患者口腔菌群中norank_o_Izimaplasmatales,Brevundimonas,Parabacteroides,Sphaerochaeta和Odoribacter属微生物较为富集,但这些种属的含量比较低。与此不同,健康对照口腔菌群中富集的微生物属有Porphyromonas,Prevotella,Peptostreptococcus,Eubacterium nodatum group,Solobacterium 和Ruminococcaceae UGG 014。我们又进一步比较了差异属中占比前四的属,结果表明健康对照口腔菌群中Porphyromonas(6.44±3.87 VS.3.57±4.1,P<0.01),Prevotella(5.47±3.30 VS.3.40±2.78,P<0.0 1),Peptostreptococcus(1.09±0.84 VS.0.56±0.57,P<0.01)和Eubacterium_nodatum_group(0.41±0.40 VS.0.23±0.29,,P<0.05)属微生物显著增加。此外,链球菌在肠化患者中偏多,但并未有统计学差异(IM:HC,19.69±8.74:16.24±9.17,P>0.05)。研究结论:1、与健康对照相比,胃肠上皮化生患者十二指肠黏膜菌群具有显著改变,包括多样性、菌群结构等改变。2、十二指肠菌群结构不受幽门螺旋杆菌感染影响,而胃黏膜菌群结构受幽门螺旋杆菌感染影响;3、胃肠化生患者口腔菌群存在多样性和菌群结构的改变。