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第一部分圆锥绣球提取物总香豆素苷治疗免疫性肾病的药效和分子机制研究
目的:免疫性肾病是导致肾病综合征的重要原因之一，表现为肾小球毛细血管袢上皮侧有大量免疫复合物的沉积，目前临床上缺少有效治疗手段，主要以激素或小分子免疫抑制剂，但长期服用副作用大。本研究构建阳离子化牛血清白蛋白诱导形成的大鼠免疫性肾病模型，评价圆锥绣球总香豆素苷(Hydangea paniculata，HP)对于治疗免疫性肾病的药效，并利用体内外模型深入探究其分子机制。
方法:连续14天尾静脉注射阳离子牛血清白蛋白(Cationzed-BSA，c-BSA)诱导免疫性肾病模型，造模，对出现蛋白尿的大鼠进行随机分组，开始给予霉酚酸酯(Mycophenolate mofetil,MMF)(20mg/kg)和HP(7.5、15、30mg/kg)治疗。整个给药时间持续6周，在此期间，每隔3周眼球取血并收集大鼠尿液。分析HP对各项生化指标的影响。6周后，取各组大鼠肾脏组织进行病理切片及电镜观察，分析HP对肾脏病理损伤的影响，并取大鼠肾脏组织做全转录组测序，分析HP显著影响的mRNA并对其进行KEGG富集，探究HP作用的潜在通路。体外培养RAW264.7和HK-2细胞，在转化生长因子1(Transforminggrowthfactorβ1，TGF-β1)刺激或脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)刺激后，研究HP及其代谢产物降低IL-10的作用机制，茵芋苷(Skimmin)是HP的主要成分，是HP发挥药效的主要部分。观察茵芋苷及其代谢产物对NFκB以及PI3K-AKT信号通路的影响并研究skimmin及其代谢产物对淋巴细胞增殖的影响。同时探究skimmin及其代谢产物与TGF-β/smad通路的关系。最后，借助体外补体激活模型，探究HP对补体通路的作用效果以及机制。
实验结果:实验证实，HP可以降低免疫性肾病大鼠血中尿素氮(Blood urea nitrogen，BUN)和血肌酐(Serum creatinine，SCr)的含量，并显著降低尿微量白蛋白。同时，HP还可以显著降低大鼠血中的甘油三酯(Triglyceride，TG)以及总胆固醇(Cholesterol，CHO)的含量。肾脏组织病理染色分析表示，HP可以显著减少肾小球的损伤比率以及近曲小管的管壁厚度，肾小管空泡变性以及炎性细胞的浸润也得到缓解。电镜分析可知，HP治疗显著降低肾小球基底膜的厚度以及缓解足细胞的融合情况。通过转录组测序并用RT-PCR以及Westernblot验证，HP显著影响了纤维化相关通路和PI3K-AKT信号通路。体外细胞实验表明，skimmin及其代谢产物可以显著抑制LPS诱导的巨噬细胞分泌IL-10的水平，及其它炎症因子的表达。Westernblot表明skimmin及其代谢产物是通过抑制NF-κB的表达与磷酸化以及PI3K-AKT通路来发挥抗炎作用，并且减少了B淋巴细胞对肾脏的浸润;另外，skimmin及其代谢产物可以通过负调节TGF-β/smad通路，降低smad2/3的磷酸化，减少细胞外基质Ⅳ型胶原以及纤粘蛋白(Fibronectin，FN)的产生。最后，体内外补体激活的实验表明HP和它的主要成分skimmin以及其代谢产物均可以显著降低补体蛋白C3的合成和分泌，发挥抑制补体激活的作用。
结论:HP对c-BSA诱发的免疫性肾病有着良好的治疗效果，能够显著改善免疫性肾病大鼠的肾功能，并改善脂代谢缓解疾病的进展。其主要分子机制主要与以下三个方面，抗炎、抗纤维化以及抑制补体激活相关。HP可以抑制纤维化相关通路、抑制PI3K-AKT通路、减少巨噬细胞对肾脏组织的浸润以及抑制淋巴细胞的增殖以及抑制补体蛋白C3的激活来发挥抗慢性肾脏疾病的药效。
关键词:圆锥绣球;茵芋苷;免疫性肾病;纤维化;抗炎免疫;补体
第二部分免疫性肾病中与补体系统激活相关的LncRNA的发现和验证
目的:补体系统的激活几乎涉及所有不同病因导致的CKD。本研究旨在利用c-BSA诱导的大鼠免疫肾病模型，发现与补体通路激活相关的长链非编码RNA(Long noncoding RNA，LncRNA)，并进行验证。
实验方法:尾静脉注射c-BSA2周，建立实验大鼠免疫性肾病模型，检测尿中白蛋白以及血中补体C3对模型进行评价。取大鼠肾脏采用全转录组测序，发现在正常组与模型组显著差异并与补体通路相关的LncRNA，Blast找到与人同源的LncRNA，使用体内外补体激活模型，确证这些LncRNA的表达与补体系统重要组分的表达成相关性。
实验结果:与空白对照组相比，模型组的大鼠尿白蛋白显著增高，血中C3含量显著降低。通过测序结果分析，筛选出与补体通路相关的518条显著变化的LncRNA后，并在这其中找到12条与人有同源性的LncRNA，并验证了它们与补体相关mRNA(C5、C7、C4bpa)的表达量以及大鼠血清中C3的含量有很好的相关性。
结论:建立的大鼠免疫性肾病模型在一定程度上能够反映人类MN的病理特征，并通过该模型发现了与人有同源性的12条补体相关LncRNA，为将来治疗免疫性肾病以及与补体相关疾病提供了新的诊断依据及新的治疗靶点。其具体的分子机制有待进一步探究。
目的:免疫性肾病是导致肾病综合征的重要原因之一，表现为肾小球毛细血管袢上皮侧有大量免疫复合物的沉积，目前临床上缺少有效治疗手段，主要以激素或小分子免疫抑制剂，但长期服用副作用大。本研究构建阳离子化牛血清白蛋白诱导形成的大鼠免疫性肾病模型，评价圆锥绣球总香豆素苷(Hydangea paniculata，HP)对于治疗免疫性肾病的药效，并利用体内外模型深入探究其分子机制。
方法:连续14天尾静脉注射阳离子牛血清白蛋白(Cationzed-BSA，c-BSA)诱导免疫性肾病模型，造模，对出现蛋白尿的大鼠进行随机分组，开始给予霉酚酸酯(Mycophenolate mofetil,MMF)(20mg/kg)和HP(7.5、15、30mg/kg)治疗。整个给药时间持续6周，在此期间，每隔3周眼球取血并收集大鼠尿液。分析HP对各项生化指标的影响。6周后，取各组大鼠肾脏组织进行病理切片及电镜观察，分析HP对肾脏病理损伤的影响，并取大鼠肾脏组织做全转录组测序，分析HP显著影响的mRNA并对其进行KEGG富集，探究HP作用的潜在通路。体外培养RAW264.7和HK-2细胞，在转化生长因子1(Transforminggrowthfactorβ1，TGF-β1)刺激或脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)刺激后，研究HP及其代谢产物降低IL-10的作用机制，茵芋苷(Skimmin)是HP的主要成分，是HP发挥药效的主要部分。观察茵芋苷及其代谢产物对NFκB以及PI3K-AKT信号通路的影响并研究skimmin及其代谢产物对淋巴细胞增殖的影响。同时探究skimmin及其代谢产物与TGF-β/smad通路的关系。最后，借助体外补体激活模型，探究HP对补体通路的作用效果以及机制。
实验结果:实验证实，HP可以降低免疫性肾病大鼠血中尿素氮(Blood urea nitrogen，BUN)和血肌酐(Serum creatinine，SCr)的含量，并显著降低尿微量白蛋白。同时，HP还可以显著降低大鼠血中的甘油三酯(Triglyceride，TG)以及总胆固醇(Cholesterol，CHO)的含量。肾脏组织病理染色分析表示，HP可以显著减少肾小球的损伤比率以及近曲小管的管壁厚度，肾小管空泡变性以及炎性细胞的浸润也得到缓解。电镜分析可知，HP治疗显著降低肾小球基底膜的厚度以及缓解足细胞的融合情况。通过转录组测序并用RT-PCR以及Westernblot验证，HP显著影响了纤维化相关通路和PI3K-AKT信号通路。体外细胞实验表明，skimmin及其代谢产物可以显著抑制LPS诱导的巨噬细胞分泌IL-10的水平，及其它炎症因子的表达。Westernblot表明skimmin及其代谢产物是通过抑制NF-κB的表达与磷酸化以及PI3K-AKT通路来发挥抗炎作用，并且减少了B淋巴细胞对肾脏的浸润;另外，skimmin及其代谢产物可以通过负调节TGF-β/smad通路，降低smad2/3的磷酸化，减少细胞外基质Ⅳ型胶原以及纤粘蛋白(Fibronectin，FN)的产生。最后，体内外补体激活的实验表明HP和它的主要成分skimmin以及其代谢产物均可以显著降低补体蛋白C3的合成和分泌，发挥抑制补体激活的作用。
结论:HP对c-BSA诱发的免疫性肾病有着良好的治疗效果，能够显著改善免疫性肾病大鼠的肾功能，并改善脂代谢缓解疾病的进展。其主要分子机制主要与以下三个方面，抗炎、抗纤维化以及抑制补体激活相关。HP可以抑制纤维化相关通路、抑制PI3K-AKT通路、减少巨噬细胞对肾脏组织的浸润以及抑制淋巴细胞的增殖以及抑制补体蛋白C3的激活来发挥抗慢性肾脏疾病的药效。
关键词:圆锥绣球;茵芋苷;免疫性肾病;纤维化;抗炎免疫;补体
第二部分免疫性肾病中与补体系统激活相关的LncRNA的发现和验证
目的:补体系统的激活几乎涉及所有不同病因导致的CKD。本研究旨在利用c-BSA诱导的大鼠免疫肾病模型，发现与补体通路激活相关的长链非编码RNA(Long noncoding RNA，LncRNA)，并进行验证。
实验方法:尾静脉注射c-BSA2周，建立实验大鼠免疫性肾病模型，检测尿中白蛋白以及血中补体C3对模型进行评价。取大鼠肾脏采用全转录组测序，发现在正常组与模型组显著差异并与补体通路相关的LncRNA，Blast找到与人同源的LncRNA，使用体内外补体激活模型，确证这些LncRNA的表达与补体系统重要组分的表达成相关性。
实验结果:与空白对照组相比，模型组的大鼠尿白蛋白显著增高，血中C3含量显著降低。通过测序结果分析，筛选出与补体通路相关的518条显著变化的LncRNA后，并在这其中找到12条与人有同源性的LncRNA，并验证了它们与补体相关mRNA(C5、C7、C4bpa)的表达量以及大鼠血清中C3的含量有很好的相关性。
结论:建立的大鼠免疫性肾病模型在一定程度上能够反映人类MN的病理特征，并通过该模型发现了与人有同源性的12条补体相关LncRNA，为将来治疗免疫性肾病以及与补体相关疾病提供了新的诊断依据及新的治疗靶点。其具体的分子机制有待进一步探究。