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【目的】
1.构建放射性脑损伤(RBI )小鼠模型并对其海马组织进行微小RNA(miRNA)及转录组测序,以筛选可能的疾病调控基因。
2.研究AntagomiR-741鼻腔给药对于RBI的预防作用。
3.探索AntagomiR-741在调控RBI疾病进程中的潜在调控机制。
【方法】
1.建立RBI模型小鼠:10只小鼠随机分为对照组和照射组。充分麻醉小鼠后将其固定在固定器上,使用医用线性加速器对小鼠进行30Gy全脑照射。6周后,行水迷宫测试后处死小鼠。收集海马组织进行微小RNA测序(miRNA-Seq)、转录组测序和实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)验证。
2.AntagomiR-741鼻腔给药可行性验证:12只小鼠随机分为对照组和AntagomiR-741组。AntagomiR-741组鼻腔给予AntagomiR-741,对照组给予等量无酶水,给药后24小时处死小鼠,qRT-PCR检测miR-741-3p的相对表达。
3.AntagomiR-741在RBI模型小鼠中的功能作用验证:将30只小鼠随机分为对照组(鼻腔给予无酶水)、照射组(鼻腔给予无酶水+照射)和AntagomiR-741组(鼻腔给予AntagomiR-741+照射),每组10只。照射后1周,每组取3只小鼠进行qRT-PCR检测。照射后6周,每组其余7只小鼠在完成行为学测试后处死。取其双侧海马行qRT-PCR、苏木精和伊红(HE)染色、酶联免疫吸附试验(ELISA)与免疫荧光试验。
【结果】
1.RBI模型小鼠的建立和验证:给予小鼠30Gy全脑照射6周后,与对照组相比,照射组小鼠在水迷宫实验中第4-5天的逃避潜伏期延长(P<0.05)。撤去平台后,照射组在目的象限的时间、路程以及虚拟平台穿越次数均少于正常组(P<0.05)。与对照组相比,照射组神经元数量减少,胞质深染,出现核分裂和组织水肿。
2.RBI模型小鼠海马组织中差异表达的miRNA鉴定:RBI模型小鼠海马组织的miRNA-Seq数据分析显示,与对照组相比,照射引起了多个miRNA的上下调。其中miR-741-3p被显著上调(P<0.0001)。qRT-PCR检测进一步证明miR-741-3p在照射后显著上调(P<0.01)。
3.AntagomiR-741逆转海马组织中miR-741-3p的上调:与对照组及照射组相比,AntagomiR-741组海马中的miR-741-3p相对表达在给药24小时、1周和6周后下调(P<0.05,P<0.05,P=0.1125)。
4.AntagomiR-741预防RBI引发的认知功能障碍:照射后6周,AntagomiR-741组第3、4、5天的逃避潜伏期比照射组显著减少(P<0.05,P<0.05,P<0.01)。且AntagomiR-741组在水迷宫实验第6天的目的象限时间、目的象限路程、虚拟平台穿越次数均大于照射组(P<0.01,P<0.05,P<0.05)。Y迷宫中AntagomiR-741组在新异臂的探索时间和自发性交替实验正确率均较照射组显著增加(P<0.05)。
5.AntagomiR-741防止辐射后小胶质细胞和星形胶质细胞转化为活化状态:基于Iba-1和GFAP的免疫荧光分析提示AntagomiR-741预防了照射导致的小胶质细胞的突触变短(P<0.05),星型胶质细胞GFAP综合光密度显著降低(P<0.05)。
6.AntagomiR-741降低照射后海马组织中促炎因子水平和神经元凋亡比率:ELISA检测提示AntagomiR-741降低了照射导致的海马组织中的IL-6、TNF-α升高(P<0.05),以及外周血中的S100B升高(P<0.01),并减少了放射导致的神经元凋亡比率的增高(P<0.01)。
7.AntagomiR-741靶基因预测:miRNA数据库与转录组测序结合的结果提示,Ddr2,PKCα和St8sia1可能是AntagomiR-741调控RBI发生发展中的潜在功能靶标。
【结论】
1.MiR-741-3p在RBI模型小鼠海马组织中显著上调。
2.通过鼻腔给予AntagomiR-741可降低RBI模型小鼠海马组织中miR-741-3p的相对表达水平。
3.鼻腔给予AntagomiR-741对辐射引起的胶质细胞激活、认知障碍和神经元损伤有一定的预防作用。
4.Ddr2,PKCα和St8sia1可能是AntagomiR-741预防RBI进展的潜在靶标。
1.构建放射性脑损伤(RBI )小鼠模型并对其海马组织进行微小RNA(miRNA)及转录组测序,以筛选可能的疾病调控基因。
2.研究AntagomiR-741鼻腔给药对于RBI的预防作用。
3.探索AntagomiR-741在调控RBI疾病进程中的潜在调控机制。
【方法】
1.建立RBI模型小鼠:10只小鼠随机分为对照组和照射组。充分麻醉小鼠后将其固定在固定器上,使用医用线性加速器对小鼠进行30Gy全脑照射。6周后,行水迷宫测试后处死小鼠。收集海马组织进行微小RNA测序(miRNA-Seq)、转录组测序和实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)验证。
2.AntagomiR-741鼻腔给药可行性验证:12只小鼠随机分为对照组和AntagomiR-741组。AntagomiR-741组鼻腔给予AntagomiR-741,对照组给予等量无酶水,给药后24小时处死小鼠,qRT-PCR检测miR-741-3p的相对表达。
3.AntagomiR-741在RBI模型小鼠中的功能作用验证:将30只小鼠随机分为对照组(鼻腔给予无酶水)、照射组(鼻腔给予无酶水+照射)和AntagomiR-741组(鼻腔给予AntagomiR-741+照射),每组10只。照射后1周,每组取3只小鼠进行qRT-PCR检测。照射后6周,每组其余7只小鼠在完成行为学测试后处死。取其双侧海马行qRT-PCR、苏木精和伊红(HE)染色、酶联免疫吸附试验(ELISA)与免疫荧光试验。
【结果】
1.RBI模型小鼠的建立和验证:给予小鼠30Gy全脑照射6周后,与对照组相比,照射组小鼠在水迷宫实验中第4-5天的逃避潜伏期延长(P<0.05)。撤去平台后,照射组在目的象限的时间、路程以及虚拟平台穿越次数均少于正常组(P<0.05)。与对照组相比,照射组神经元数量减少,胞质深染,出现核分裂和组织水肿。
2.RBI模型小鼠海马组织中差异表达的miRNA鉴定:RBI模型小鼠海马组织的miRNA-Seq数据分析显示,与对照组相比,照射引起了多个miRNA的上下调。其中miR-741-3p被显著上调(P<0.0001)。qRT-PCR检测进一步证明miR-741-3p在照射后显著上调(P<0.01)。
3.AntagomiR-741逆转海马组织中miR-741-3p的上调:与对照组及照射组相比,AntagomiR-741组海马中的miR-741-3p相对表达在给药24小时、1周和6周后下调(P<0.05,P<0.05,P=0.1125)。
4.AntagomiR-741预防RBI引发的认知功能障碍:照射后6周,AntagomiR-741组第3、4、5天的逃避潜伏期比照射组显著减少(P<0.05,P<0.05,P<0.01)。且AntagomiR-741组在水迷宫实验第6天的目的象限时间、目的象限路程、虚拟平台穿越次数均大于照射组(P<0.01,P<0.05,P<0.05)。Y迷宫中AntagomiR-741组在新异臂的探索时间和自发性交替实验正确率均较照射组显著增加(P<0.05)。
5.AntagomiR-741防止辐射后小胶质细胞和星形胶质细胞转化为活化状态:基于Iba-1和GFAP的免疫荧光分析提示AntagomiR-741预防了照射导致的小胶质细胞的突触变短(P<0.05),星型胶质细胞GFAP综合光密度显著降低(P<0.05)。
6.AntagomiR-741降低照射后海马组织中促炎因子水平和神经元凋亡比率:ELISA检测提示AntagomiR-741降低了照射导致的海马组织中的IL-6、TNF-α升高(P<0.05),以及外周血中的S100B升高(P<0.01),并减少了放射导致的神经元凋亡比率的增高(P<0.01)。
7.AntagomiR-741靶基因预测:miRNA数据库与转录组测序结合的结果提示,Ddr2,PKCα和St8sia1可能是AntagomiR-741调控RBI发生发展中的潜在功能靶标。
【结论】
1.MiR-741-3p在RBI模型小鼠海马组织中显著上调。
2.通过鼻腔给予AntagomiR-741可降低RBI模型小鼠海马组织中miR-741-3p的相对表达水平。
3.鼻腔给予AntagomiR-741对辐射引起的胶质细胞激活、认知障碍和神经元损伤有一定的预防作用。
4.Ddr2,PKCα和St8sia1可能是AntagomiR-741预防RBI进展的潜在靶标。