猪流感(Swineinfluenza，SI)是由猪流感病毒(Swineinfluenzavirus，SIV)引起的一种急性、热性、高度接触性呼吸道传染病，已造成世界养猪业巨大损失。SIV的血凝素(hemagglutinin，HA)是诱导机体产生体液免疫的主要表面抗原，产生的抗体能中和病毒的感染能力，并能诱导细胞毒性T淋巴细胞反应。本研究的目的是构建表达H3N2亚型SIVHA基因的重组腺病毒，并考察其免疫效果，为SI腺病毒活载体疫苗的研制奠定基础。 根据GenBank数据库提供的H3亚型SIVHA基因的核酸序列设计了一对引物，并在HA基因上、下游分别引入限制性内切酶BglⅡ的识别位点序列。用RT-PCR技术从H3N2亚型SIV基因组RNA中扩增出长约1.7kb的HA基因eDNA，将其回收后与pMD18-T载体连接，获得重组质粒pMD18-T-HA。DNA序列测定结果表明：插入片段全长1701bp，包含HA基因完整阅读框架。用BglⅡ对重组质粒pMD18-T-HA进行部分酶切，回收约1.7kb的目的基因片段，与经BglⅡ酶切及去磷酸化处理的穿梭载体质粒连接，转化DH5α感受态细胞，随机挑选卡那霉素抗性菌落，采用两对引物进行PCR鉴定，证实HA基因正向插入穿梭载体质粒。该重组质粒经PmeⅠ线性化和去磷酸化处理后，与腺病毒基因组质粒pAdenoVator△E1/E3共转化BJ5183感受态菌进行同源重组。经质粒电泳初筛及PCR鉴定，筛选出重组腺病毒载体质粒，将该质粒经PacⅠ酶切并纯化后，转染293细胞，获得携HA基因的重组腺病毒rAd-HA-GFP。Western-blot分析表明rAd-HA-GFP能在体外培养细胞中介导HA基因的表达。 为研究rAd-HA-GFP的免疫效果，利用40日龄仔猪和18～20g雌性昆明鼠(SPF级)进行一系列的试验。将rAd-HA-GFP以1mL、2mL、4mL三个接种剂量分别接种40日龄流感抗体阴性仔猪，免疫后2到6周每周检测血凝抑制(HI)抗体，发现4mL接种组产生的抗体高于其他两组，差异显著(P＜0.01)。比较肌注、滴鼻、灌胃三种途径的免疫效果后发现，肌注组抗体最高，差异显著(P＜0.01)。中和试验表明，HI抗体水平与中和抗体水平之间呈正相关关系。 通过攻毒保护试验进一步考察rAd-HA-GFP的免疫效力。选取HI滴度为1：80，1：160，1：320的仔猪各5头作为免疫组。攻毒后从临床症状、发烧率、带毒率、HI抗体水平变化来考察免疫保护效果。结果表明，rAd-HA-GFP诱导的免疫反应能有效抵抗H3N2亚型SIV的侵袭，具有作为SIV候选疫苗株的可能性。抗体水平达到1：320可以起到完全保护作用。 昆明鼠经腹腔注射接种rAd-HA-GFP后第14天即可检测到HI抗体，抗体可持续3个月。该抗体能在体外中和H3N2亚型SIV的感染力。比较腹腔注射、灌胃、滴鼻三种接种途径对昆明鼠的免疫效果，发现腹腔注射组诱导的抗体水平最高，差异显著(P＜0.01)。 将该重组腺病毒在293细胞中连续传12代后，PCR检测证实插入rAd-HA-GFP的HA基因可以稳定遗传。第4、8、12代病毒TCID50值与原代病毒基本一致，分别为10-8.2/mL、10-8.7/mL、10-8.4/mL和10-8.3/mL。比较第4、8、12代传代毒株对昆明鼠的免疫效果后发现，各代次病毒均能有效刺激机体产生HI抗体，差异不显著(P＞0.05)。