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目的:本实验以高脂合并心肌缺血再灌注损伤(MIRI)模型大鼠为研究对象,探讨益脉颗粒对线粒体自噬及线粒体融合、裂解的影响,旨从线粒体自噬及线粒体动力学的角度揭示益脉颗粒对MIRI的防治作用及分子机制。材料与方法:将100只大鼠随机分为5组,分别为假手术组、模型组、益脉颗粒高、中、低剂量组,每组20只。假手术组大鼠常规饲养,其余各组给予高脂饲料喂养2周,其他条件相同。假手术组、模型组大鼠每次灌服生理盐水10ml/kg,益脉颗粒高、中、低剂量组每次灌服中药煎液10ml/kg,灌胃日2次;缺血再灌注造模前连续给药1周。各组大鼠心肌缺血30分钟再灌注2小时后,原位结扎冠状动脉左前降支,经颈动脉迅速灌注2ml的伊文斯蓝,待染料分布到全心组织后(前降支灌注区除外),快速取出心脏,生理盐水冲洗,冻存于-20℃,后进行心肌梗死面积测定。同时大鼠腹主动脉进行取血,后分离血清备用。心肌梗死面积测定取材剩余的心脏组织冻存于-80℃超低温冰箱中备用。本研究共分为三部分探讨益脉颗粒对高脂合并MIRI大鼠心肌损伤的防治作用及分子机制。1.益脉颗粒对高脂合并MIRI大鼠e NOS、NO的影响全自动生化分析仪检测各组大鼠血脂(TC、TG、LDL-C、HDL-C)水平;TTC染色法测定缺血再灌注后各组大鼠心肌梗死面积;HE染色观察各组大鼠心肌细胞形态及炎症浸润情况;比色法检测各组大鼠血清CK、CK-MB、LDH、HBDH酶活性;硝酸还原酶化学比色法测各组大鼠血清NO含量;Western blot技术检测大鼠心肌组织e NOS蛋白相对表达量。2.益脉颗粒调控PINK1-Parkin通路对高脂合并MIRI大鼠心肌线粒体自噬的影响提取各组大鼠心肌组织线粒体,JC-1法测定线粒体膜电位;Western blot技术检测大鼠心肌组织Cytc及自噬标记蛋白LC3II/I、Beclin1蛋白,线粒体自噬相关蛋白PINK1、Parkin、P62蛋白的相对表达量。3.益脉颗粒对高脂合并MIRI大鼠心肌线粒体融合、裂解、合成相关蛋白的影响Western blot技术检测大鼠心肌细胞内线粒体融合蛋白(OPA1、Mfn1、Mfn2蛋白),线粒体分裂蛋白(Drp1、Fis1蛋白),线粒体生物合成相关蛋白(PGC-1α蛋白)的相对表达量。结果:1.与假手术组大鼠相比,模型组大鼠血清TC、TG、LDL-C含量显著升高(p<0.01),HDL-C含量显著降低(p<0.01);与模型组大鼠相比,益脉颗粒高剂量组大鼠血清TC、TG、LDL-C含量显著降低(p<0.01),HDL-C含量显著升高(p<0.01),益脉颗粒中剂量组大鼠血清TG、LDL-C含量显著降低(p<0.01)或(p<0.05),HDL-C含量显著升高(p<0.01)或(p<0.05),益脉颗粒低剂量组大鼠血清TG含量显著降低(p<0.01),HDL-C含量显著升高(p<0.05);与益脉颗粒高剂量组大鼠相比,益脉颗粒中、低剂量组大鼠血清TC、LDL-C含量显著升高(p<0.01)或(p<0.05),低剂量组大鼠血清HDL-C含量显著降低(p<0.01)或(p<0.05),益脉颗粒高剂量效果优于中、低剂量。2.假手术组大鼠心肌未见梗死;与假手术组大鼠相比,模型组大鼠心肌梗死面积百分比显著升高,梗死区占左心室总面积百分率为17.89%。益脉颗粒高、中、低剂量干预后,较假手术组均能明显降低大鼠心肌梗死面积百分比(p<0.01)。益脉颗粒高、中剂量组作用效果明显优于益脉颗粒低剂量组。3.与假手术组大鼠相比,模型组大鼠血清HBDH、CK-MB、CK及LDH含量显著升高(p<0.01),药物干预后,益脉颗粒高、中、低剂量组大鼠血清HBDH、CK-MB、CK及LDH含量显著降低(p<0.01);与益脉颗粒高剂量组大鼠相比,益脉颗粒中剂量组大鼠血清CK及LDH含量明显升高(p<0.01),益脉颗粒低剂量组大鼠血清CK-MB、CK及LDH含量显著升高(p<0.01);益脉颗粒高剂量组作用效果优于中、低剂量组。4.假手术组大鼠心肌组织结构清晰,心肌纤维排列整齐,未见心肌纤维变性、坏死,肿胀及炎性细胞浸润等病理改变。与假手术组大鼠相比,模型组大鼠心肌出现广泛性心肌纤维变性、坏死,间质水种,毛细血管扩张及炎性细胞的浸润。与模型组大鼠相比较,益脉颗粒高、中剂量给药组大鼠心肌组织出现轻度的肌纤维变性及水肿,炎性细胞的浸润也有所减轻,未见其他异常。5.与假手术组大鼠相比,模型组大鼠血清NO含量显著降低(p<0.01),药物干预后,益脉颗粒高、中、低剂量组大鼠血清NO含量显著升高(p<0.01)。6.与假手术组大鼠相比,模型组大鼠心肌e NOS蛋白相对表达水平显著降低(p<0.05),药物干预后,益脉颗粒高剂量组大鼠心肌e NOS蛋白相对表达水平显著升高(p<0.05),其余各组大鼠心肌e NOS蛋白相对表达水平呈上升趋势,但差异无统计学意义。7.与假手术组大鼠相比,模型组大鼠线粒体膜电位显著降低(p<0.01);与模型组大鼠相比,益脉颗粒高剂量组大鼠线粒体膜电位显著升高(p<0.01);益脉颗粒中剂量组,益脉颗粒低剂量组大鼠线粒体膜电位呈上升趋势,但差异无统计学意义。8.与假手术组大鼠相比,模型组大鼠心肌Cytc、LC3II/I、Beclin1蛋白相对表达量显著升高(p<0.01);与模型组大鼠相比,益脉颗粒高、中剂量组大鼠心肌Cytc、LC3II/I、Beclin1蛋白相对表达量显著降低(p<0.01)或(p<0.05),益脉颗粒低剂量组大鼠心肌Cytc、Beclin1蛋白相对表达量显著降低(p<0.05),LC3II/I有下降趋势,无统计学意义。9.与假手术组大鼠相比,模型组大鼠心肌PINK1、Parkin蛋白相对表达量显著升高,P62蛋白相对表达量显著降低(p<0.01)或(p<0.05);与模型组大鼠相比,益脉颗粒高、中剂量组大鼠心肌PINK1、Parkin蛋白相对表达量显著降低,P62蛋白相对表达量显著升高(p<0.01)或(p<0.05),益脉颗粒低剂量组大鼠心肌PINK1蛋白相对表达量显著降低,P62蛋白相对表达量显著升高(p<0.01),Parkin有下降趋势,无统计学意义。10.与假手术组大鼠相比,模型组大鼠心肌PGC-1α蛋白表达降低(p<0.01),与模型组大鼠相比,益脉颗粒高、中、低剂量组大鼠心肌PGC-1α蛋白相对表达量显著增强(p<0.01)或(p<0.05)。11.与假手术组大鼠相比,模型组大鼠心肌OPA1、Mfn1蛋白表达降低,Mfn2蛋白表达增加(p<0.01)或(p<0.05);与模型组大鼠相比,益脉颗粒高剂量组大鼠心肌Mfn2蛋白表达降低,Mfn1、OPA1蛋白表达升高,益脉颗粒中、低剂量组大鼠心肌Mfn1、OPA1蛋白表达升高(p<0.01)或(p<0.05),Mfn2蛋白表达有降低趋势,无统计学意义。12.与假手术组大鼠相比,模型组大鼠心肌Drp1、Fis1蛋白表达增加(p<0.01)。与模型组大鼠相比,益脉颗粒高、中剂量组大鼠心肌Drp1、Fis1蛋白表达降低,益脉颗粒低剂量组大鼠心肌Fis1蛋白表达降低(p<0.01)或(p<0.05)。结论:1.益脉颗粒能纠正高脂合并MIRI大鼠血脂异常,减轻心肌损伤。2.益脉颗粒对高脂合并MIRI大鼠心肌的保护作用可能与线粒体质量控制有关。3.益脉颗粒可能通过PINK1/Parkin通路调控线粒体自噬提高线粒体膜电位。4.益脉颗粒可能通过调控线粒体融合蛋白、裂解蛋白、线粒体合成相关蛋白等,调控线粒体动态平衡进而对高脂合并MIRI大鼠心肌起保护作用。