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背景与目的动脉粥样硬化是一种常见的心血管疾病,严重威胁着人类的健康。在动脉粥样硬化病变过程中,易损斑块破裂会引起大脑或心脏动脉的急性阻塞,是造成死亡的首要原因。已经有研究证明,各种原因导致的动脉粥样斑块内泡沫细胞凋亡(尤其巨噬细胞凋亡)是导致易损斑块形成的重要原因。易损斑块形成机制的研究至关重要,但是传统的动脉粥样硬化动物模型很难建立易损斑块模型,使得很多研究依然停留在相关性的发现,无法进行更深入的探索。大肠杆菌嘌呤核苷酸磷酸化酶(ePNP)是一类前药转换酶自杀基因,可将腺嘌呤类似物Fludarabine转换成毒性物质,杀伤细胞。清道夫受体(SR)A是一种巨噬细胞表面的糖蛋白,研究证明其启动子区域部分片段具有巨噬细胞特异性。本研究将SR-A启动子核心区以及增强子区与自杀基因ePNP相连接,构建过表达载体,建立了具有巨噬细胞特异性的SR-A-ePNP转基因小鼠,再将SR-A-ePNP转基因小鼠与经高脂饲养较易获得血管斑块的ApoE-/-小鼠进行杂交,获得SR-A-ePNP-ApoE-/-纯合子小鼠,通过高脂饲养在血管内形成斑块,腹腔注射前体药物Fludarabine后与ePNP共同作用诱导斑块内巨噬泡沫细胞发生不同程度的凋亡,初步建立易损斑块模型。STAT1作为IFN-y,TLR4和IL-6活化途径之间的连接点,具有放大炎症信号的作用,Fludarabine作为STAT1的抑制剂很可能会对SR-A-ePNP-ApoE-/-小鼠模型动脉粥样硬化的发生发展产生影响,对本研究造成干扰。白喉毒素(DT)对人类细胞敏感却无法对小鼠细胞产生作用,本研究后续将特异性表达质粒进行改进,构建了巨噬细胞特异性表达人类白喉毒素受体(HBEGF)的SR-HBEGF质粒,将其转染小鼠巨噬泡沫细胞后,通过白喉毒素诱导小鼠巨噬泡沫细胞发生特异性凋亡,为新型易损斑块模型的建立和完善奠定了基础。方法一 SR-A-ePNP-ApoE-/-转基因小鼠易损斑块模型的初步建立构建SR-A-ePNP过表达载体,建立转基因小鼠,繁殖鉴定SR-A-ePNP阳性小鼠,将SR-A-ePNP转基因小鼠与ApoE-/-小鼠杂交繁殖后代,PCR反应鉴定出SR-A-ePNP-ApoE-/-纯合子小鼠,通过高脂饲养使小鼠血管壁生成动脉粥样硬化斑块,在前体药物Fludarabine作用下诱导斑块内巨噬泡沫细胞凋亡,通过HE染色鉴定组织结构,ANNEXIN V-FITC/PI Apoptosis检测以及TUNEL反应进行凋亡鉴定。二 SR-A-ePNP 到 SR-A-HBEGF 质粒的改进以SR-A-ePNP为模板扩增SR-A增强子与启动子区,与pUCm-T载体相连接;将白喉毒素受体基因HBEGF插入pcDNA3.1载体中扩增HBEGF与BGHpolyA尾片段;然后将HBEGF与BGHpolyA尾片段与pUCm-T载体中的SR-A增强子与启动子区相连接,SR-A-HBEGF过表达质粒构建完成。将质粒分别转染巨噬细胞与肥大细胞,通过荧光定量PCR以及蛋白印迹,免疫组化等分别在mRNA水平以及蛋白水平鉴定其表达情况。转染泡沫化的巨噬细胞并经白喉毒素诱导凋亡,通过TUNEL染色鉴定其功能。结果一 SR-A-ePNP-ApoE-/-转基因小鼠易损斑块模型的初步建立1.普通PCR鉴定出阳性SR-A-ePNP转基因小鼠,目前Zi,Z2,Z3,Z7四个系SR-A-ePNP转基因小鼠已经传代到7-8代,基因ePNP表达稳定。2.将阳性SR-A-ePNP转基因小鼠F0与ApoE-/-小鼠F0杂交繁殖得到Fi代小鼠,将F1代小鼠继续杂交繁殖,通过PCR鉴定出SR-A-ePNP-ApoE-/-纯合子小鼠。目前Z2系小鼠的杂交后代已传至第6代,其他系的杂交小鼠传至3代,基因遗传均稳定,只能通过鉴定来选择需要的SR-A-ePNP-ApoE-/-纯合子小鼠。3.使用前体药物Fludarabine注射SR-A-ePNP-ApoE-/-转基因小鼠腹腔后,提取其腹腔巨噬细胞,通过流式细胞仪凋亡检测,发现Fludarabine可诱导巨噬细胞凋亡,且凋亡率与药剂浓度正相关。4.使用不同浓度前体药物Fludarabine注射SR-A-ePNP-ApoE-/-小鼠腹腔后,取小鼠的肝脾等组织,通过TUNEL染色发现,Fludarabine浓度在60mg/kg以内时,对含有巨噬细胞的其他脏器造成严重损伤。5.高脂饲养SR-A-ePNP-ApoE-/-小鼠形成斑块,使用不同浓度前体药物Fludarabine注射小鼠腹腔,取小鼠含有斑块的血管组织进行TUNEL染色鉴定斑块内巨噬泡沫细胞发生不同程度的凋亡,30mg/kg时斑块内泡沫细胞的凋亡量明显少于60mg/kg时的凋亡量。二 SR-A-ePNP 到 SR-A-HBEGF 质粒的改进1.构建了具有巨噬细胞特异性的质粒pUCm-T-SR-A-HBEGF。2.普通PCR分别鉴定转染该质粒的巨噬细胞与肥大细胞,发现只有转染巨噬细胞组能够扩增人类白喉毒素基因的条带。3.定量PCR鉴定转染巨噬细胞组目的基因的表达量高于其他组。4.Wester blot与免疫组化鉴定转染巨噬细胞组能够表达目的基因。5.分别通过不同浓度的oxLDL诱导巨噬细胞泡沫化,油红O染色鉴定巨噬细胞均发生泡沫化。6.将质粒转染巨噬细胞后,使用oxLDL泡沫化,通过白喉毒素诱导其凋亡,通过TUNEL染色,鉴定转染组表达的人类白喉毒素受体功能正常。结论一初步建立SR-A-ePNP-ApoE-/-转基因小鼠易损斑块模型本研究建立了 SR-A-ePNP-ApoE-/-转基因小鼠模型,高脂饲养后通过前体药物Fludarabine可诱导斑块内巨噬泡沫细胞发生不同程度的凋亡,从而初步完成了新型易损斑块模型建立。二将质粒SR-A-ePNP改进为质粒SR-A-HBEGF本研究在质粒SR-A-ePNP的基础上重新构建了巨噬细胞特异性表达的质粒SR-A-HBEGF,经鉴定可在巨噬细胞内表达,通过白喉毒素可诱导巨噬泡沫细胞发生凋亡。