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1973年,西雅图的研究人员Jones和Smith公布了一系列孕期酒精暴露相关症状的研究结果,并将其正式命名为胎儿酒精中毒综合症(Fetal Alcohol Syndrome, FAS)。自此以后,越来越多的研究者加入到孕期酒精暴露引起的胎儿出生缺陷的研究中。在机制方面,关于胎儿酒精中毒综合征的遗传学及表观遗传学机制也有越来越多的报道。相比之下,男性长期酗酒导致后代出生缺陷的研究却极少。在有限的动物学研究中,由于酒精量、年龄及品种的差异,酒精导致雄性小鼠后代出生缺陷的表型不一,机制研究尚未涉及。尽管人们猜测,酒精作为环境致畸因子可能通过表观遗传学改变而致使后代发生出生缺陷,但迄今为止,父系酒精暴露导致胎儿酒精综合症的表观遗传学机制却鲜有报道。本研究拟从表观遗传学角度将酒精导致精子异常与后代出生缺陷相联系,先建立雄性动物长期酒精暴露导致的后代出生缺陷模型,再通过各种表观遗传学分析技术检测父本精子以及后代各组织的表观遗传修饰变化,以回答酒精究竟是否可以通过父系精子的表观遗传学变异导致后代发生出生缺陷这个关键的科学问题,并力争明确部分分子机制。本研究分为以下四个部分：一、通过对雄性KM,C57及Aldh2-/-小鼠进行为期1个月的梯度酒精(0g/kg,1g/kg和3.3g/kg)灌胃处理,检测小鼠体重、睾丸重量、附睾重量、精子密度以及精子活力等参数,对不同雄性小鼠长期酒精暴露对其生殖毒性影响进行研究。二、三种实验小鼠与正常雌鼠杂交,获得F1代小鼠,通过对其存活率、畸形率、体重及性别比统计观察F1代小鼠生长发育情况;待F1代小鼠8周龄后,对其进行高架十字、悬尾实验和水迷宫实验,对其焦虑抑郁情绪及认知能力进行评测。三、通过MassArray EpiTYPER甲基化平台,对酒精处理KM小鼠FO代精子、F1和F2代大脑皮层4个印迹基因(H19, Peg3, Ndn及Snrpn) DMR区的甲基化水平进行研究,并用QRT-PCR检测其大脑皮层中mRNA水平表达情况。四、使用酶切甲基化测序(MSCC)方法对酒精处理的C57小鼠F0代精子和F1代海马组织进行全基因组DNA甲基化分析,再利用表达谱芯片对F1代海马组织进行全转录组进行检测,最后用生物信息学进行分析和筛选,挑选酒精处理后C57小鼠FO和F1代启动子区域甲基化变化与F1代mRNA表达相一致的基因,利用MassARRAY以及QRT-PCR方法在C57小鼠和Aldh2-/-小鼠F0及F1代中,进行扩大样本的DNA甲基化和mRNA水平验证。研究结果如下：一、3.3g/kg酒精处理的F0代KM小鼠体重显著下降(p<0.05),精子密度及精子活力呈减少趋势；3.3g/kg酒精处理的C57和Aldh2-/-小鼠,其体重、睾丸和附睾重量均减少(p<0.05),精子密度呈减少趋势；随着酒精处理剂量的增加,两种小鼠睾丸内精子凋亡率增加(p<0.05)；与C57小鼠酒精处理组比较,Aldh2-/-小鼠对酒精敏感性更高,后者的死亡率高于前者；3.3g/kg酒精处理的Aldh2-/-小鼠,其睾酮激素、精子平均路径速度(VAP)及平均曲线速度(VCL)均显著减少(p<0.05)。二、对于酒精处理的三种小鼠,其F1代存活率下降(p<0.05),认知、焦虑和抑郁程度均受到不同程度影响。酒精处理的KM小鼠F1代中出现了耳聋与急速转圈两种小鼠；与对照组比较,酒精处理组F1代KM小鼠学习记忆能力显著下降,焦虑抑郁情绪增加(p<0.05)。酒精处理的F1代Aldh2-/-小鼠,其认知及抑郁情绪受影响程度高于酒精处理的C57小鼠F1代。三、在KM小鼠印迹基因甲基化检测中,我们观察到F0代雄性小鼠的精子中,高剂量酒精处理后H19与Peg3基因DMR区甲基化改变显著(p<0.05)；在F1代小鼠大脑皮层中,Peg3基因的CpG7与CpG11两个位点的甲基化变化与F0代精子中相同,有显著性差异(P<0.05)。 Snrpn基因在Fl代及F2代大脑皮层中观察到甲基化显著减少(p<0.05)。其它印迹基因在F1代均未发现显著的甲基化改变。4个印迹基因在F1代大脑皮层mRNA水平检测显示,酒精处理组Peg3基因mRNA表达有减少趋势,Snrpn基因有增加趋势,但均无统计学差异。四、利用酶切甲基化测序技术(MSCC)结合表达谱芯片对不同剂量酒精处理后C57 FO代精子及F1代海马组织全基因组启动子区域进行甲基化检测和转录组进行分析,发现F0代甲基化改变且稳定遗传给F1代,且表达水平与甲基化程度相对应的基因有12个。将这些基因在C57、Aldh2-/-小鼠F0及F1代中扩大样本进行甲基化及mRNA水平验证,结果发现Syt2基因的表达变化最有意义。进一步机制研究及筛选实验正在进行中。 综上所述,我们发现酒精长期暴露能够影响雄性小鼠生殖功能,引起精子某些基因甲基化发生改变,而这种异常的改变可传递到F1代,并导致相应的基因的表达水平发生变化,这可能是F1代出现异常的部分原因。