一、研究目的动脉粥样硬化是导致急性心脑血管事件的主要原因,“瘀热搏结”是动脉粥样硬化的重要病因病机,既往研究发现养心舒脉颗粒在治疗稳定性冠心病方面具有一定优势,其是否能抑制动脉粥样硬化斑块进展,稳定易损斑块,有待进一步深入探索研究。本课题通过质谱分析、网络药理学、体内和体外实验研究探索养心舒脉颗粒干预动脉粥样硬化的作用机制,探讨养心舒脉颗粒与TLR9/MyD88/NF-κB通路及巨噬细胞极化的关系,旨在从物质基础、生物网络、整体动物和细胞分子水平揭示养心舒脉颗粒稳定动脉粥样硬化易损斑块的作用机制,阐释方祝元教授关于动脉粥样硬化“脉痹”、“瘀热搏结”学术思想的现代科学内涵。二、研究方法1.质谱分析采用高效液相色谱-质谱/质谱联用仪（HPLC-MS/MS）测定养心舒脉颗粒的有效活性成分,高分辨液质采集的数据通过初步数据的整理,然后在数据库检索比对,根据mzCloud数据库匹配度打分,以mzCloud Best Match≥70进行筛选,最后得出有效成分信息及相关数值,揭示养心舒脉颗粒治疗作用的物质基础。2.网络药理学研究（1）养心舒脉颗粒有效活性成分靶点的收集与预测:药物有效活性成分分别通过SwissTargetPrediction和PubChem数据库平台进行检索,并获得潜在的药物成分靶点信息。（2）动脉粥样硬化相关基因的收集与筛选:动脉粥样硬化相关靶点分别通过检索TTD、DisGeNET、DrugBank、GeneCards和OMIM数据库,检索词为“动脉粥样硬化（atherosclerosis）”,根据不同数据库的筛选条件进行筛选,对筛选结果进行汇总,得到动脉粥样硬化的所有相关基因靶点信息。（3）靶点预测、蛋白互作网络图构建及核心靶点筛选:首先筛选得到疾病与药物成分的共有靶点蛋白,上传至STRING平台建立药物靶蛋白-疾病靶蛋白（PPI）相互作用网络,然后根据 Betweenness Centralities、Closeness Centralities、Degree Centralities 筛选得到核心靶点。（4）GO、KEGG生物富集分析:将上述筛选出的PPI网络靶标导入到OmicShare云平台数据库中,进行数据库可视化分析得到GO和KEGG富集分析结果。（5）“疾病-成分-靶点-通路”网络图构建:得到参与动脉粥样硬化的20条KEGG通路后,与养心舒脉颗粒有效活性成分、核心靶点一起按照数据文件和属性文件进行excel文件格式的数据编排,将其共同上传Cytoscape3.7.0软件,得到“疾病-成分-靶点-通路”多维网络关系图。（6）核心成分与核心靶点分子对接分析:选择合适配体分子结构,保存命名为lig.pdbqt,受体蛋白分子保存命名为rep.pdbqt,设置10个对接输出模型,输入对接函数,对接方式为刚性对接,得到对接结果log.txt和lig out.pdbqt文件,用PyMOL同时打开lig out.pdbqt和rep.pdbqt文件,导出10个对接结果,选择affinity最佳的结合构象。3.体内实验研究（1）养心舒脉颗粒对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块的影响:ApoE-/-小鼠随机分成Model 组（Model）、YXSMG-L 组（YXSMG-L,5.2g/kg/d）、YXSMG-H 组（YXSMG-H,11.7g/kg/d）,C57BL/6J作为空白对照组（C57）,造模8周,干预4周,检测各组小鼠体重、进食量、血脂指标,采用油红染色、H＆E染色及天狼星红染色观察各组小鼠主动脉窦斑块病变情况。（2）养心舒脉颗粒对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块炎症表达的影响:ELISA检测各组小鼠血清炎症因子（IL-6、IL-1β、TNF-α及MCP-1）表达,qPCR检测各组小鼠主动脉IL-6、IL-1β及TNF-α mRNA的表达水平,免疫荧光（IF）及蛋白印迹法（WB）检测各组小鼠主动脉IL-6及IL-1β蛋白表达水平。（3）养心舒脉颗粒对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块TLR9/MyD88/NF-KB通路的影响:qPCR检测各组小鼠主动脉TLR9 mRNA表达水平,WB及IF检测各组小鼠主动脉TLR9、MyD88、p-IκB 及 p-p65 蛋白表达水平。（4）养心舒脉颗粒对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块巨噬细胞M1/M2极化状态的影响:IF检测各组小鼠主动脉窦巨噬细胞CD86、CD163表型蛋白表达水平。4.体外实验研究（1）养心舒脉颗粒对RAW264.7巨噬细胞活性的影响及ODN1826对RAW264.7巨噬细胞TLR9的激动作用:CCK-8及WB筛选ODN1826造模浓度及时间,观察养心舒脉颗粒对ODN1826激动的RAW264.7巨噬细胞炎症损伤的保护作用,并筛选出两个养心舒脉颗粒有效浓度（YXSMG-L、YXSMG-H）,WB 及 qPCR 检测 OND1826 激动 RAW264.7巨噬细胞TLR9的表达。（2）养心舒脉颗粒对ODN1826激动的RAW264.7巨噬细胞TLR9/MyD88/NF-κB通路的影响:IF及WB检测养心舒脉颗粒干预OND1826激动的RAW264.7巨噬细胞TLR9/MyD88/NF-κB通路蛋白的表达水平。（3）养心舒脉颗粒对ODN1826激动的RAW264.7巨噬细胞M1/M2极化状态的影响:ELISA、qPCR及IF检测养心舒脉颗粒干预OND1826激动的RAW264.7巨噬细胞M1/M2相关表型分子的表达水平。（4）抑制TLR9对RAW264.7巨噬细胞TLR9/MyD88/NF-κB通路和M1/M2极化状态的影响及养心舒脉颗粒的干预作用:CCK-8及WB筛选ODN2088的干预浓度及时间,WB及IF检测ODN2088干预及养心舒脉颗粒处理对ODN1826激动RAW264.7巨噬细胞TLR9/MyD88/NF-κB通路相关蛋白的表达水平,IF及流式细胞术检测ODN2088干预及养心舒脉颗粒处理对ODN1826激动的RAW264.7巨噬细胞M1/M2相关表型分子的表达水平。三、研究结果1.质谱分析采用HPLC-MS/MS测定养心舒脉颗粒的有效活性成分,得到儿茶素、芒柄花黄素、丹参酮ⅡA、隐丹参酮、黄豆黄素五个有效活性化合物成分,进而为养心舒脉颗粒有效成分的标准提供一定依据,并为其药物研发及后续实验提供参考。2.网络药理学研究通过网络药理学筛选的得到关键靶点22个,主要包括EGFR、IL-6、JUN、RELA、TNF、TLR9等。通过GO富集分析结果得到养心舒脉颗粒干预动脉粥样硬化的生物过程、细胞组分及分子功能主要与代谢、脂质、氧化应激、细胞内信号转导等相关,提示养心舒脉颗粒可能通过介导细胞内的信号转导来调节脂质代谢从而起到干预动脉粥样硬化相关生物、细胞及分子机制的作用。从KEGG通路富集分析结果可知养心舒脉颗粒干预动脉粥样硬化主要涉及流体剪切力、炎症、Toll样受体通路、细胞极化等通路,提示养心舒脉颗粒可能介导Toll样受体调节巨噬细胞极化从而抑制炎症起到改善和稳定动脉粥样硬化斑块的作用机制。通过计算机模拟分子对接验证发现,核心化合物与核心靶点蛋白具有良好的结合能力,初步揭示养心舒脉颗粒与动脉粥样硬化之间的“多成分-多靶点-多通路”的作用网络关系。3.体内实验研究（1）养心舒脉颗粒可以降低高脂喂养ApoE-/-小鼠体重,降低血清TC、TG、LDL-C血脂水平,升高血清HDL-C水平,改善动脉粥样硬化斑块大小及炎性浸润。（2）养心舒脉颗粒可以降低高脂喂养ApoE-/-小鼠血清IL-1β、IL-6、MCP-1及TNF-α炎症因子水平,降低主动脉IL-1β、TNF-α及IL-6mRNA水平,降低主动脉IL-1β及IL-6蛋白表达。（3）养心舒脉颗粒可以降低主动脉TLR9、MyD88、p-IκB及p-p65的蛋白表达,从体内验证了养心舒脉颗粒对TLR9/MyD88/NF-κB信号通路的抑制作用。（4）养心舒脉颗粒可以降低主动脉窦CD86表达水平,增加CD163表达水平。4.体外实验研究（1）养心舒脉颗粒可以降低ODN1826激动的RAW264.7巨噬细胞TLR9 mRNA的表达及IL-6、IL-1β蛋白表达水平。（2）养心舒脉颗粒可以抑制ODN1826激动的RAW264.7巨噬细胞TLR9、MyD88及p-IκB蛋白表达水平,并且养心舒脉颗粒干预后降低了核内p65的表达水平,进一步证实了养心舒脉颗粒对TLR9/MyD88/NF-κB信号通路的抑制作用。（3）养心舒脉颗粒可以降低ODN1826激动的RAW264.7巨噬细胞TNF-α、IL-6及IL-1β mRNA表达水平,升高Arg1及IL-10 mRNA表达水平,进一步证实了养心舒脉颗粒能够抑制巨噬细胞向M1型极化,促进巨噬细胞向M2型极化。（4）ODN2088 抑制了 ODN1826 激动的 RAW264.7 巨噬细胞 TLR9/MyD88/NF-κB 通路相关蛋白的表达水平,并且ODN2088与养心舒脉颗粒发挥协同一致的作用。（5）养心舒脉颗粒及ODN2088可以使ODN1826激动的RAW264.7巨噬细胞CD86表达降低,CD163表达升高。四、结论养心舒脉颗粒可以降低高脂喂养ApoE-/-小鼠血脂水平,改善动脉粥样硬化斑块大小及炎症浸润,机制层面上得出养心舒脉颗粒可以通过抑制TLR9/MyD88/NF-κB通路重编程巨噬细胞M1/M2极化状态进而减轻动脉炎症从而达到改善动脉粥样硬化斑块的作用机制。