论文部分内容阅读
林蛙油是雌性林蛙输卵管的干燥品,是收录《中国药典》的中药材。蛋白质是林蛙油中主要活性成分,占到50%以上,水溶性林蛙油蛋白（PEOR）具有抗氧化、抗疲劳、抗衰老和增强机体免疫力等作用。因此,为系统研究PEOR,基于活性保留,本论文结合抗氧化活性跟踪首先对PEOR的提取工艺进行研究,并进一步考察其体内外抗氧化活性和抗疲劳作用,发现:PEOR体内抗氧化活性高,而体外作用弱。基于此,本论文模拟蛋白体内消化过程与程序,采用胃蛋白酶/胰蛋白酶分步水解法制备林蛙油酶解肽,并对其氨基酸组成与抗氧化活性进行研究。应用水提法提取PEOR,结合DPPH清除率,以pH值、料液比、提取时间、提取次数和浸提液含盐量为五个单因素考察指标,优化提取工艺,确定最佳提取条件为:pH 6.5的磷酸缓冲溶液（含0.5 mol/L的NaCl）,在料液比1:150条件下浸提2次,每次浸提12 h;此条件下PEOR提取率为12.5%,经考马斯亮蓝法测得蛋白质含量为60.7%;应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定PEOR分子量分布,发现:PEOR在44.3-116 kDa范围内主要有三个单体蛋白。对PEOR中氨基酸组成进行分析,结果表明:PEOR中有17种氨基酸,其中7种为必需氨基酸,占41.9%,氨基酸总含量为668.3 mg/g。以羟自由基清除率、DPPH自由基清除率、超氧阴离子清除率和总还原力为体外抗氧化模型,VC为阳性对照,评价PEOR体外抗氧化活性。结果表明,PEOR清除羟自由基、DPPH自由基和超氧阴离子的IC50值分别为4.85 mg/mL、4.98mg/mL和2.58 mg/mL;对Fe3+的还原能力,在A700 nm值为0.2时,浓度为11.8mg/mL。以丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）和蛋白质羰基（PC）为指标,VC为阳性对照,评价PEOR的体内抗氧化活性。结果表明,PEOR能降低小鼠体内MDA和PC含量,提高GSH和SOD水平,且呈量效关系。其中,400 mg/kg的PEOR对负重游泳小鼠具有显著的抗疲劳作用,能延长小鼠的负重疲劳游泳时间,减少剧烈运动引起的血尿素氮（BUN）和血乳酸（BLA）的升高。胃蛋白酶/胰蛋白酶分步水解法制备林蛙油酶解肽的工艺条件为:脱脂林蛙油,加入50倍量人工胃液,水解2 h,调节pH至8.5,再次水解4 h,水浴快速高温灭酶。在此条件下林蛙油酶解肽的提取率为31.5%;以羟自由基清除率、DPPH清除率、超氧阴离子清除率和总还原力四个体系,VC为阳性对照,考察林蛙油酶解肽抗氧化活性。结果表明,林蛙油酶解肽清除羟自由基、DPPH和超氧阴离子的IC50值分别为3.96 mg/mL、3.25 mg/mL和2.58 mg/mL;对Fe3+的还原能力,在A700nm值为0.2时,浓度为11.8 mg/mL。综合以上结果,PEOR体内抗氧化效果优于体外,胃蛋白酶/胰蛋白酶分步水解法制备的林蛙油酶解肽的抗氧化活性高于PEOR。