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研究背景:心力衰竭是一个快速增长的公共卫生问题,全球患病人数目前已经超过6430万人。心衰是心脏功能损害的共同慢性阶段,也是各种心血管疾病的终末阶段。心肌纤维化作为高血压、冠心病、心肌病、心脏瓣膜病、心包炎等多种心血管疾病的重要病理学特征,是导致心力衰竭的主要途径。近年来越来越多的研究表明内皮间质转化（Endothelial M esenchymal Transition,EndMT）是心肌纤维化发生的主要机制之一,因此抑制EndMT可能是治疗心肌纤维化,防治心力衰竭的一个新方向。芪参六味方的主要功效为益气活血化瘀,补益肝肾,临床用于治疗高血压合并舒张功能不全患者。课题组前期研究表明芪参六味方显著改善了高血压患者的左室舒张功能,降低左室舒张末期内径,其主要药物可抑制心肌重塑。而心肌纤维化是破坏心肌正常结构,使心肌兴奋-收缩耦合失调,并损害心肌收缩和舒张功能的病理过程。因此,本研究使用芪参六味方干预转化生长因子-1（Transforming Growth Factor-1,TGF-β1）诱导的人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs）EndMT 模型,探讨芪参六味方治疗心肌纤维化可能的机制。研究目的:观察芪参六味方干预TGF-β1诱导的HUVECs细胞EndMT模型,探讨芪参六味方治疗心肌纤维化可能的机制。研究方法:1.制备TGF-β1诱导的HUVECs细胞EndMT模型:使用终浓度为10ng/mlTGF-β1诱导HUVECs细胞,分别在1小时、24小时、48小时、72小时用倒置显微镜观察细胞形态变化,并用CCK-8法检测不同时间段TGF-β1对HUVECs细胞毒性与活力影响;再通过免疫荧光双标法检测模型细胞内皮细胞特异性表型标志物血小板内皮细胞粘附分子-1（Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule-1,PECAM-1/CD31）和间质细胞特异性标志物α-肌动蛋白（α-Smooth Muscle Actin,α-SMA）的荧光变化。2.筛选药物最佳剂量:将芪参六味方肠吸收液及氯沙坦钾稀释成不同浓度,分别与TGF-β1共同培养HUVECs细胞,用CCK-8法检测不同浓度的药物对HUVECs细胞毒性与活力影响。3.分组及给药:①对照组:HUVECs+含2%空白肠吸收液无血清培养基;②模型组:HUVECs+10ng/mlTGF-β1+含2%空白肠吸收液无血清培养基;③中药组:HUVECs+10 ng/mlTGF-β1+含2%芪参六味方肠吸收液无血清培养基;④阳性药组:HUVECs+1 Ong/mlTGF-β1+含2%空白肠吸收液无血清培养基+2μM氯沙坦钾。4.免疫荧光双标法观察各实验组HUVECs细胞CD31和α-SMA荧光强度与细胞内定位。5.Realtime RT-PCR 法检测各实验组 HUVECs 细胞 CD31、α-SMA、MMP-9、Coll agenⅠ、CollagenⅢ、TIMP-1、TGF-β1、Smad2、Smad3、Slug、Snail、β-catenin 的 mRN A的表达情况。6.Western Blot 法检测各实验组 HUVECs 细胞 CD31、α-SMA、MMP-9、CollagenI、CollagenⅢ、TIMP-1、TGF-β1、Smad2、Smad3、Slug、Snail、β-catenin 蛋白的表达情况。研究结果:1.倒置显微镜结果示:对照组细胞间连接紧密,排列整齐,边缘圆钝,呈鹅卵石状或者铺路石状。TGF-β1诱导HUVECs细胞48小时后可明显引起细胞变为梭形或者不规则形的成纤维细胞样外观,而芪参六味方和氯沙坦钾可以抑制TGF-β1对HUVECs细胞形态影响,形态与对照组相似。2.CCK-8结果示:与对照组相比,模型组细胞OD值无明显差异（P＞0.05）;与模型组相比,中药组OD值显著上升（P＜0.01）,阳性药组OD值无明显差异（P＞0.05）。3.免疫荧光结果示:与对照组相比,TGF-β1诱导HUVECs细胞的内皮细胞标记物CD31的平均荧光密度明显降低（P＜0.01）,而间质细胞标记物α-SMA的平均荧光密度明显升高（P＜0.01）。与模型组相比,中药组与阳性药组CD31的平均荧光密度升高（P＜0.05,P＜0.01）,α-SMA的平均荧光密度明显降低（P＜0.01）。4.Realtime RT-PCR 结果:4.1 HUVECs细胞内皮细胞标记物CD31及间质细胞标记物α-SMA mRNA的表达情况:与对照组相比,模型组细胞内皮细胞标志物CD31 mRNA表达下降（P＜0.05）,而间质细胞标志物α-SMA mRNA表达明显升高（P＜0.01）。与模型组相比,中药组和阳性药组可以降低α-SMA mRNA的表达（P＜0.05）;中药组CD31 mRNA表达有升高趋势,但是差异无统计意义（P＞0.05）,阳性药组CD31 mRNA表达降低（P＜0.05）。4.2 HUVECs细胞Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原的mRNA表达情况:与对照组相比,模型组细胞Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原mRNA表达升高（P＜0.05）,其中Ⅰ型胶原mRNA表达明显升高（P＜0.01）。与模型组相比,中药组和阳性药组可以明显降低Ⅰ型胶原mRNA表达（P＜0.01）;中药组Ⅲ型胶原mRNA表达有降低趋势,但是差异无统计意义（P＞0.05）,阳性药组Ⅲ型胶原mRNA表达降低（P＜0.05）。4.3 HUVECs细胞MMP-9、TIMP-1的mRNA表达情况:与对照组相比,模型组MMP-9 mRNA明显升高（P＜0.01）,TIMP-1mRNA表达降低（P＜0.05）。与模型组相比,中药组和阳性药组MMP-9 mRNA表达明显下降（P＜0.01）,中药组TIMP-1mRNA表达无明显差异（P＞0.05）,阳性药组TIMP-1mRNA表达升高（P＜0.05）,差异有统计学意义。4.4 HUVECs细胞TGF-β1、Smad2、Smad3的mRNA表达情况:与对照组相比,模型组TGF-β1、Smad2、Smad3的mRNA表达显著升高（P＜0.01）。与模型组相比,中药组和阳性药组可以显著下调TGF-β1、Smad2、Smad3的mRNA表达（P＜0.01）,差异具有统计学意义。4.5 HUVECs细胞Slug、Snail、β-catenin的mRNA表达情况:与对照组相比,模型组细胞明显上调Slug、Snail、β-catenin的mRNA表达（P＜0.01）。与模型组相比,中药组Slug、Snail的mRNA表达明显下调（P＜0.01）,β-catenin mRNA表达无明显差异（P＞0.05）;阳性药组 Slug、Snail、β-catenin 的 mRNA 表达下降（P＜0.05）,其中Snail mRNA明显下调（P＜0.01）,差异有统计学意义。5.Western Blot 结果:5.1 HUVECs细胞内皮细胞标记物CD31及间质细胞标记物α-SMA的蛋白表达情况:与对照组相比,模型组HUVECs细胞CD31蛋白表达含量下降（P＜0.05）,α-SMA蛋白表达含量明显升高（P＜0.01）;与模型组相比,中药组和阳性药组内皮细胞标志CD31蛋白表达水平增高（P＜0.05）,间质细胞标志物α-SMA蛋白含量明显降低（P＜0.01）。5.2 HUVECs细胞Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原的蛋白表达情况:与对照组相比,模型组细胞Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原的蛋白表达升高（P＜0.05）,其中Ⅰ型胶原的蛋白表达明显升高（P＜0.01）;与模型组相比,中药组和阳性药组可以降低Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的蛋白表达（P＜0.05）。5.3 HUVECs细胞MMP-9、TIMP-1的蛋白表达情况:与对照组相比,模型组MMP-9的蛋白明显升高（P＜0.01）,TIMP-1的蛋白表达下降（P＜0.05）。与模型组相比,中药组和阳性药组MMP-9的蛋白表达下降（P＜0.05）,TIMP-1 mRNA蛋白表达无明显差异（P＞0.05）。5.4 HUVECs细胞TGF-β1、Smad2、Smad3的蛋白表达情况:与对照组相比,模型组TGF-β1、Smad2和Smad3的蛋白表达显著升高（P＜0.01）。与模型组相比,中药组和阳性药组可以下调TGF-β1、Smad2和Smad3的蛋白表达（P＜0.01）,差异具有统计学意义。5.5 HUVECs细胞Slug、Snail、β-catenin的蛋白表达情况:与对照组相比,模型组细胞Slug、Snail、β-catenin的蛋白表达明显上调（P＜0.01）。与模型组相比,中药组和阳性药组Slug、Snail和β-catenin的蛋白表达明显下调（P＜0.01）。结论:1.TGF-β1可以诱导HUVECs细胞向间充质细胞表型转化。2.芪参六味方可以抑制TGF-β1诱导HUVECs细胞的EndMT过程,恢复MMPs/TIMPs二者之间的动态平衡,从而调节细胞外基质的合成与降解,抑制胶原沉积,进而抑制心肌纤维化,其机制可能与调控TGF-β/Smads信号通路、Wnt/β-catenin 信号通路相关。