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杆状病毒-昆虫细胞多基因表达系统因为具有能容纳大片段外源基因插入、表达量高、能同时表达多个基因、安全等特点,成为研究多蛋白复合物的最佳系统。MultiBac系统是目前在杆状病毒多基因表达系统中,实现真核多蛋白复合物或者单个基因多拷贝在昆虫细胞中表达的有力工具。该系统由2个供体载体pFBDM和pUCDM和改造过的受体Bacmid组成。其中pFBDM载体来源于pFastdual,含有Tn7转座序列和GM抗性基因,含有双启动子(p10和多角体polh启动子)、2个MCS、2个polyA加尾信号序列(SV40,HSVtk)。pUCDM含R6kγ条件型复制子和CM抗性基因,还有一个loxp位点,受体Bacmid保留了原有的Tn7转座受体位点,又引入了1个loxp位点。转移载体pFBDM携带外源基因Tn7转座进MultiBacmid,转移载体pUCDM携带外源基因经Cre/Loxp位点特异性重组进MultiBacmid,可同时实现多个基因表达。
理论认为,整合的拷贝数与基因的表达量会遵循剂量效应,即随着拷贝数的增加,蛋白表达量会逐渐提高;也有研究认为基因拷贝数和蛋白表达量没有直接线性关系,但是在杆状病毒表达系统中是否遵循基因剂量效应,目前为止尚未见相关报道。
本实验以gfp为目的基因,来探究基因拷贝数对杆状病毒在昆虫细胞中蛋白表达量的影响。Gfp基因是一个广泛使用的报告基因,它可以在昆虫细胞中正常表达,经蓝光(488nm)激发,被激发出绿色荧光(512nm),检测方便。利用MultiBac系统构建了七种含有不同拷贝gfp基因的重组病毒rAcMultiBac-p10-gfp、rAcMultiBac-ph-gfp、rAcMultiBac-p10-ph-2gfp、rAcMultiBac-p10-2ph-3gfp、rAcMultiBac-2p10-ph-3gfp、rAcMultiBac-2p10-2ph-4gfp和rAcMultiBac-3p10-3ph-6gfp。用自制的EGFP多克隆兔抗体进行Western Blot检测,并通过激光共聚焦和荧光分光光度计首先对两个极晚期启动子p10和ph的活性进行了比较,得出ph控制表达的EGFP荧光蛋白表达量要比p10控制的的表达量高1倍。然后对含不同基因gfp拷贝数的重组病毒(一到四拷贝)在昆虫细胞中的表达情况进行了定性和定量分析,发现蛋白表达量随着基因拷贝数增加而增加,但不是呈线性比例倍数增长,当拷贝数由1增加3时,荧光蛋白表达量提高了近2倍,从0.2％提高到了0.41％;拷贝数为4时,荧光蛋白表达量比单拷贝提高了20倍;对2gfp,4gfp和6gfp的重组病毒蛋白表达情况进行了比较,发现随着基因gfp拷贝数以2倍形式增加时,四拷贝荧光蛋白表达量最高,到六拷贝时有所下降。因此在杆状病毒表达系统中,通过提高基因拷贝数能显著提高目标蛋白表达量,而且只需要构建携带四拷贝外源基因就可以获得最佳表达效果,为杆状病毒多基因表达系统高效表达外源基因提供了理论基础和技术路线。