人类基因组计划发现,人体大概有23,000个编码基因,远远少于转录出来的蛋白质种类。究其原因,超过百分之九十以上的人类基因存在着RNA可变剪接,从而丰富了蛋白质种类。生物体通过精细调控基因的可变剪接,能够对环境压力作出及时准确的应答,从而维持了生物学稳定性,甚至可以为进化提供物质基础。在肿瘤发展中,基因异常的可变剪接往往会减少抑癌转录本的表达,同时伴随着促癌转录本的增加。随着二代测序技术的普及,越来越多的异常可变剪接受到了关注。作为一种新型的肿瘤标志物,发生异常剪接的基因往往涉及肿瘤血管生成,侵袭迁移,免疫逃避以及细胞代谢等多种癌症通路。SR蛋白家族(Serine/arginine-rich RNA binding protein)属于丝氨酸-精氨酸富集蛋白,它在前体RNA的剪接过程中发挥着极为重要的作用。SR蛋白能够识别结合前体RNA上的剪接元件,继而招募组装剪接体从而促进或抑制剪接事件的发生。肿瘤中,SR蛋白的异常表达导致RNA异常剪接,从而促进肿瘤细胞的增殖及迁移,抑制肿瘤的凋亡。例如,作为SR蛋白家族的主要成员之一,SRSF6在多种肿瘤中存在着拷贝数的扩增,在皮肤癌中,高表达水平SRSF6能够导致细胞黏合素C(TNC)基因的异常可变剪接,从而促进皮肤癌的增殖。本实验室前期结果表明,长链非编码RNALINC01133能够通过与SRSF6蛋白结合从而抑制其诱导的上皮间质转化作用,然而SRSF6在结直肠癌发生发展过程中的下游靶点,及其如何通过与下游靶点的结合进行剪接作用等一系列的机制目前尚不清楚。为此,本课题以结直肠癌为模型,围绕以下几点展开:探讨SRSF6在结直肠癌中的生物学功能;鉴定SRSF6调控的下游剪接靶基因以及SRSF6识别结合的RNA基序;分析鉴别SRSF6发挥剪接调控的结构域并以此为基础进行药物设计及筛选评价。1、SRSF6在结直肠癌中的表达及意义通过TCGA基因拷贝数数据集,发现SRSF6基因拷贝数在结直肠癌病人中显著增加,SRSF6高拷贝数与其mRNA表达量成正相关,并且SRSF6高表达的病人预后较差;通过逆转录荧光定量PCR检测本实验室311例配对结直肠癌病人样本库,发现SRSF6在结直肠癌肿瘤样本中高表达,并且高表达的病人预后显著较差。为了进一步探索SRSF6的生物学功能,在六种结直肠癌细胞系中敲低SRSF6表达后,通过CCK8,transwell侵袭迁移实验,软琼脂克隆形成实验,发现SRSF6敲低以后细胞的侵袭迁移以及增殖克隆形成能力均显著下降,而过表达同义突变的SRSF6质粒能够恢复以上肿瘤细胞生物学表型。此外,利用裸鼠皮下成瘤,尾静脉注射肺转移活体成像及小鼠炎症诱导结直肠癌模型对以上体外实验结果进一步验证。2、SRSF6识别特异性的RNA基序从而调控下游靶基因的剪接为了进一步探讨SRSF6在调控剪接中的分子机制,在结直肠癌细胞SW620中稳定敲低SRSF6,通过二代测序技术检测转录组,对差异可变剪接事件进行分析,并利用逆转录半定量PCR对分析结果进行验证。同时,在SRSF6过表达的细胞系中,通过RNA免疫共沉淀实验将与SRSF6结合的RNA进行分离,并使用二代测序技术检测鉴定SRSF6结合的RNA,联合差异可变剪接数据预测了 SRSF6的RNA结合基序。并采用凝胶迁移实验以及可变剪接报告基因对预测的结合基序进行了实验验证。3、SRSF6调控ZO-1可变剪接促进肿瘤进程作为SRSF6的下游靶基因,紧密连接蛋白ZO-1存在两种不同的可变剪接转录本:23号外显子保留的转录本(E23+)以及23号外显子缺失转录本(E23-)。当SRSF6敲低以后,细胞中ZO-IE23+转录本增加并能抑制肿瘤侵袭迁移能力,而当增加的ZO-1 E23+转录本被siRNA敲低后,细胞的侵袭迁移能力又得到了恢复。为了进一步探讨ZO-1 E23+同E23-转录本在结直肠癌中的功能,在六种结直肠癌细胞系中检测了两种转录本的表达水平。设计特异性siRNA干扰ZO-1 E23+转录本以及同时干扰ZO-1整体RNA。我们发现,当ZO-1E23+被干扰后,细胞的侵袭迁移能力明显上升,而ZO-1E23-不影响细胞侵袭迁移能力。同时,在裸鼠皮下成瘤以及炎症诱导结直肠癌小鼠模型中,发现SRSF6表达与ZO-1第23号外显子剪接呈正相关,并且在311对结直肠正常肿瘤配对组织样本中对以上结果进行了验证。重要的是,通过临床样本中ZO-1的剪接情况分析,发现ZO-1第23号外显子的保留往往预示着更好的临床预后结果。4、茚达特罗通过阻断SRSF6的功能抑制结直肠癌的进程为了探讨SRSF6在结直肠癌中发挥生物学功能的关键结构域,在SRSF6敲低的细胞中,过表达不同的SRSF6截断蛋白,发现RRM2结构域在SRSF6介导的侵袭迁移作用中发挥重要的作用,并且通过凝胶迁移实验验证RRM2结构域与SRSF6特异的RNA结合基序具有较好的亲和性。由于SRSF6蛋白晶体结构尚未见报道,通过计算机同源模建模拟SRSF6蛋白结构,并且针对RRM2结构域潜在RNA结合口袋,在4855个FDA批准药物中进行筛选潜在的SRSF6抑制剂,虚拟筛选发现作为慢性阻塞性肺病的长效药茚达特罗可能具有阻断SRSF6的作用。在体外实验中,通过逆转录PCR对茚达特罗处理的细胞中可变剪接事件进行分析,确认了茚达特罗具有拮抗SRSF6的剪接调控作用,并通过体外实验检测茚达特罗对结直肠癌的抑制作用;在炎症诱导小鼠结直肠癌模型中,我发现低剂量茚达特罗组小鼠肿瘤灶相对于对照组明显减少,高剂量茚达特罗能够完全抑制结直肠癌。基于以上实验结果,得出了以下结论:(1)结直肠癌中异常高表达的剪接因子SRSF6能够促进结直肠癌的增殖与迁移作用,并且高表达SRSF6预示着较差的病人预后,可以作为结直肠癌组织的一个独立标志物;(2)SRSF6能够调控大量的RNA剪接,通过结合到ZO-1前体RNA第23号外显子,SRSF6能够促进第23号外显子的剪接从而促进结直肠癌的转移,在肿瘤样本中,第23号外显子的保留伴随着更好的病人预后,因此ZO-1的可变剪接可以作为结直肠癌组织的一个独立标志物;(3)根据“老药新用”的思想,发现慢性阻塞性肺疾病药物茚达特罗能够阻断SRSF6的剪接调控功能,并且在体内体外模型中对结直肠癌具有抑制作用,可以作为一种潜在的结直肠癌临床治疗药物。