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目的:研究基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪（matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS）对细菌鉴定和耐药菌同源性分析方面在临床实验室应用的可行性。方法:收集2015年1月至2016年1月我院临床标本分离获得的非重复样本,共440株。首先,利用VITEK 2全自动微生物鉴定及药敏系统（采用传统生化反应技术）和VITEK MS全自动快速微生物质谱仪（采用MALDI-TOF MS技术）对这些株细菌进行鉴定。然后,将上述方法鉴定结果不一致菌株再用细菌核糖体16S rRNA基因序列分析进行鉴定;同时,对基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪在检测周转时间（Turn-around time,TAT）方面的优势进行评价。此外,收集2017年10月12月,经改良Hodge实验（Modified Hodge test,MHT）筛选为阳性的肺炎克雷伯菌95株。利用多位点序列分型（Multilocus sequence typing,MLST）、Microflex TM质谱仪（采用MALDI-TOF MS技术）分别分析95株菌的同源性。结果:以VITEK 2鉴定结果为参考,VITEK MS全自动快速微生物质谱仪鉴定的440株菌种水平总正确率为96.6%,菌属水平总正确率为99.1%。16S rRNA对15株不一致的菌株鉴定结果显示,在菌种水平上VITEK MS全自动快速微生物质谱仪有3株鉴定不准确,VITEK 2全自动微生物鉴定及药敏系统有12株鉴定不准确（P=0.034）。研究中VITEK 2全自动微生物鉴定及药敏系统鉴定每株需约8小时完成测试,VITEK MS全自动快速微生物质谱仪全部鉴定仅需8小时即可完成实验,平均每株菌需1分钟左右;95株CRKP的MLST分型分为9种序列型,以ST11为主占91.6%。MicroflexTM质谱仪聚类分析结果显示95株菌分为两大类,5个亚类。其中Ⅰb和Ⅰc亲缘关系较近,Ⅰa与Ⅰb、Ⅰc较远。结论:上述研究结果表明,MALDI-TOF MS可以完成对临床常见细菌的鉴定,在菌种水平上的鉴定能力MS比传统生化反应鉴定更有优势;在TAT时间上,MALDI-TOF MS大大的缩短了鉴定时间,比传统方法更有优势;通过MLST对CRKP分型显示:95株菌共有9个序列型,其中主要分型为ST11型,与国内流行调查报道结果一致。MALDI-TOF MS聚类分析结果显示95株菌间的亲缘关系分析比MLST分型更细致。