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目的探讨miR-185在人肝癌细胞和正常肝细胞中的差异表达以及miR-185对肝癌细胞生长增殖、侵袭和迁移能力的影响,并确定miR-185直接作用的靶基因,以期为肝癌发生发展、侵袭转移的具体分子机制提供理论依据,并为肝癌的早期诊断和发现治疗性靶标提供理论基础。方法1构建miR-185过表达载体pc DNA3/pri-miR-185,合成miR-185的反义寡聚核苷酸miR-185 ASO(ASO-185),然后经脂质体转染人肝癌细胞系Hep G2和SMMC-7721,实验分为四组,转染pc DNA3/pri-miR-185质粒组(miR-185组)、转染pc DNA3空载质粒组(pc DNA3组)、转染ASO-185组(ASO-185组)和转染乱序寡聚核苷酸组(ASO-NC)。2实时荧光定量PCR技术检测过表达miR-185以及miR-185功能受抑制后肝癌细胞Hep G2中miR-185 m RNA表达水平的变化。3运用CCK-8和细胞克隆形成实验观察miR-185对肝癌细胞系Hep G2和SMMC-7721增殖能力的影响。4采用Transwell小室实验观察miR-185对肝癌细胞系Hep G2和SMMC-7721侵袭和迁移能力的影响。5生物信息学数据库预测结合基因芯片结果确定miR-185的侯选靶基因NR1D1并利用荧光报告载体实验验证miR-185对靶基因的直接调控作用。6利用实时荧光定量PCR和Western blotting技术检测过表达miR-185以及miR-185功能受抑制后肝癌细胞系Hep G2和SMMC-7721中靶基因NR1D1 m RNA和蛋白表达水平的变化。结果1实时荧光定量PCR实验结果显示,在肝癌细胞Hep G2中过表达miR-185后,与pc DNA3组比较,miR-185组细胞中miR-185 m RNA表达水平升高,差异具有统计学意义(P<0.01);封闭细胞中内源性miR-185的功能后,与ASO-NC组比较,ASO-185组细胞中miR-185 m RNA表达水平降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。2 CCK-8实验结果显示,在肝癌细胞系Hep G2和SMMC-7721中过表达miR-185后,与pc DNA3组比较,miR-185组细胞增殖减慢,差异均具有统计学意义(P<0.01);封闭细胞中内源性miR-185的功能后,与ASO-NC组比较,ASO-185组细胞增殖加快,差异均具有统计学意义(P<0.01)。3细胞克隆形成实验结果显示,在肝癌细胞系Hep G2和SMMC-7721中过表达miR-185后,与pc DNA3组比较,miR-185组细胞克隆形成能力下降,差异均具有统计学意义(P<0.01);封闭细胞中内源性miR-185的功能后,与ASO-NC组比较,ASO-185组细胞克隆形成能力增强,差异均具有统计学意义(P<0.01)。4 Transwell小室实验结果表明,在Hep G2和SMMC-7721中过表达miR-185后,与pc DNA3组相比,miR-185组细胞侵袭和迁移能力明显降低,差异均具有统计学意义(P<0.01);封闭细胞中内源性miR-185的功能后,与ASO-NC组比较,ASO-185组细胞侵袭和迁移能力明显增强,差异均具有统计学意义(P<0.01)。5生物信息学数据库预测结合基因芯片、荧光报告载体实验验证,NR1D1是miR-185的直接靶基因。6在Hep G2和SMMC-7721中过表达miR-185后,与pc DNA3组比较,miR-185组细胞中NR1D1 m RNA和蛋白的表达水平降低,差异均具有统计学意义(P<0.01);封闭细胞中内源性miR-185的功能后,与ASO-NC组比较,ASO-185组细胞中NR1D1 m RNA和蛋白的表达水平升高,差异均具有统计学意义(P<0.01)。结论1 miR-185抑制肝癌细胞系Hep G2和SMMC-7721的增殖和克隆形成能力。2 miR-185抑制肝癌细胞系Hep G2和SMMC-7721的侵袭和迁移能力。3 miR-185可以负性调节Hep G2和SMMC-7721中NR1D1 m RNA和蛋白的表达水平,提示NR1D1是miR-185的直接靶基因,miR-185可能通过靶定NR1D1起到抑癌基因的作用。