微管一直是抗癌药物研发的热门靶点,药物对细胞微管的“破坏”可使细胞无法正确形成纺锤体而导致细胞增殖抑制,以达到抗癌效应。目前已发现包括紫杉醇、长春新碱及秋水仙碱为代表的多种微管靶向药物。这些药物不仅在癌症治疗上显示了重大价值,而且对细胞内微管骨架的功能研究以及微管蛋白组装分子机制的阐释做出了重要贡献。进一步寻找和发现新的微管靶向药物为新型抗癌药物的研发以及作为分子探针研究微管骨架的功能及组装机制有重要意义。本实验室从甘肃产唇形科香茶菜属植物中分离得到的一种对映贝壳杉烷类二萜类化合物,命名为wangzaozin A,发现该化合物具有稳定细胞微管组装以及促进细胞内微管蛋白聚合的作用,极可能是一种潜在的微管靶向药物。本文利用免疫荧光技术、流式细胞术,Western blot技术等实验手段,选用HeLa和HUVEC细胞株及纯化微管蛋白为研究材料,在细胞体系及非细胞体系研究了化合物wangzaozin A对微管组装的影响,主要研究结果如下:(1)通过MTT法检测不同浓度wangzaozin A对细胞生长的影响,发现0.2-2.0 μmol/L wangzaozin A对HeLa细胞有显著的生长抑制作用,流式细胞术分析显示该浓度下wangzaozin A在48 h可引起细胞G2/M周期阻滞,但并不引起细胞凋亡发生(AnnexinV/PI双染法检测)。(2)免疫荧光技术结合荧光显微镜观察,上述浓度体系下(0.8-1.4 μmol/L),wangzaozin A处理HeLa、HUVEC细胞24 h后,其微管网络面积增加(与对照组细胞相比微管面积增加39.6%),微管密度提高以及微管末端成束明显,导致细胞微管荧光染色强度明显提高(与对照组细胞相比微管荧光强度增加了 3倍)。0.8 nmol/L紫杉醇处理组也具有这样的现象。进一步Western blot实验显示,0.8-1.4 μmol/Lwangzaozin A并不改变胞质内微管蛋白的表达,只是增加聚合态微管蛋白,这些结果表明,wangzaozin A可稳定细胞内微管组装,促进微管蛋白聚合。(3)0.2-1.4 μmol/L wangzaozin A 处理 HeLa 细胞 24 h 以及 5-10 μmol/L wangzaozin A处理HeLa细胞3 h后,低温(4℃)处理15 min,观察发现对照组细胞微管几乎完全解聚,微管网络消失,微管聚集于核周形成亮斑,而wangzaozin A处理组细胞的微管解聚较少,尽管微管网络与未处理组细胞相比其密度降低,但仍保持完整;同时观察到低温不能导致细胞内微丝和角蛋白纤维解聚,wangzaozin A处理组与对照组细胞中微丝及角蛋白纤维骨架的变化一致,没有明显差异;这些结果表明wangzaozin A可以保护和抵御低温导致的微管解聚作用。(4)通过非细胞体系下微管蛋白聚合(37℃)-解聚(4℃)实验,结果表明:37℃恒温条件下,加入wangzaozin A能够显著促进微管蛋白聚合,并具有浓度依赖性。10 μmol/L wangzaozin A与1 μmol/L紫杉醇的促进效果相当。(5)微管蛋白紫杉醇结合位点的结合动力学分析,wangzaozin A可以将结合荧光素的紫杉醇衍生物Flutax-2从微管蛋白结合位点交换出来,wangzaozin A对Flutax-2的交换具有浓度依赖性,在1 wangzaozin A对Flutax-2的置换效率达到最大(97.8%)。综上,化合物wangzaozin A可促进HeLa细胞、HUVEC细胞的微管组装,改变微管动力学过程,并在非细胞体系下也具有相同的促进效应,同时也显示wangzaozin A可以与微管蛋白的紫杉醇位点结合,从而发挥与紫杉醇类似的促进微管聚合现象。上述结论表明wangzaozin A可作为潜在的抗微管药物,通过“破坏”动态平衡,抑制细胞增殖,阻滞细胞周期,对于微管靶向治疗药物的研发及作为分子探针研究微管的组装具有重要价值。