牵拉骨再生(distraction osteogenisis，DO)是骨干或干骺端截骨后，通过外固定器对截骨两端进行持续、缓慢，高频牵拉，刺激骨形成的一种独特方法，在临床上广泛用于治疗骨缺损，肢体不等长，先天性胫骨假关节，身材矮小等疾病。尽管临床上以合适的速率延长，但是新生骨的形成不总是令人满意。长时间的外固定治疗除了对病人心理和行为造成不良影响外，并发症的发生可能导致治疗的失败。因此，如何促进延长区骨愈合、减少并发症的发生是骨科医师亟待解决的问题。为促进延长区骨愈合，人们做了大量实验研究，包括对延长区进行机械刺激，电刺激，延长区移植自体骨髓细胞及成骨样细胞，局部或全身应用rhbFGF(重组人碱性成纤维细胞因子)、rhGH(重组人生长因子)，维生素D3等，虽有一定的作用，均未取得理想的效果。牵拉骨再生的骨愈合与正常骨折愈合，胚胎时期骨发育有许多相似之处，在骨生成和骨修复的过程中，有许多细胞因子，激素，细胞外基质等在调节骨再生及骨塑型的某些方面发挥重要作用，骨形态发生蛋白(BMPs)是这些因子中骨诱导性最强的因子。自1965年Urist将去矿化骨基质植入动物肌肉内，诱导异位成骨的产生，从此BMPs被描述为去矿化骨基质中引起异位成骨的物质，随后BMPs被提纯，开始应用于动物实验和临床研究，开创了骨组织工程学的新局面。BMPs已有十余种成分，其中BMP-2由于其强大的成骨能力，具有促进成骨前体细胞增殖和向成骨细胞分化的作用，在治疗临界性骨缺损，软骨缺损，脊柱融合的动物实验方面进行了大量研究，而BMP-2与牵拉骨再生的关系方面报道很少。够向成纤维细胞、骨髓基质干细胞(BMSc)是多种细胞的前体细胞，能网状细胞、脂肪细胞和成骨细胞方向转化。时，牵拉两骨端产生的张力是产生新的骨组织的重要刺激物，牵拉骨再生在牵拉期间两骨端间的日MSc对新骨形成起着重要作用，应努力促进BMSc向骨的前体细胞分化，以有利于延长区骨形成。我们研究了rhBM尸一2(重组人骨形态生成蛋白2)，b「G「对体外培养的BMSc增殖及转化的作用，建立兔胫骨延长区骨再生不良动物实验模型，研究了rhBM尸一2经皮注射到兔胫骨，延长区对于00延长骨愈合的作用，探索促进00延长区骨愈合的方法。1 BMSc培养及成骨分化的研究 目的:研究兔骨髓基质细胞的生长情况，观察细胞在培养状态下成骨分化及分化后成骨细胞的鉴定，研究BMSc短期冻存后复苏，其增殖和成骨分化的情况。方法:兔骼峭部抽取!ml骨髓进行体外培养，显微镜下观察BMSc的生长情况，用MTI.法检测细胞增长和存活情况，采用改良Gomori钙钻法计数细胞碱性磷酸酶(ALp)阳性率。冻存细胞解冻后，接种培养，观察其增长和分化情况。结果:兔骨髓基质细胞在培养条件下形成集落并持续扩增，其中部分集落碱性磷酸酶(ALP)表达阳性，细胞接近汇合时有近70%的细胞有AL尸活性表达，汇合后能够形成钙化小结。BMSc冻存复苏后成骨能力及分化能力无明显降低。结论:BMSc采集容易，增殖能力强，在体外具有明确的成骨分化能力，大量扩增及冻存复苏后成骨能力及分化能力无明显降低。深低温冰箱短期保存细胞简单、经济，有利于BMSc短期内多次培养和使用。Zrh日Mp一2，bFGF对骨髓基质干细胞增殖及转化的影响 目的:探讨rhBM尸一2，b「G「单因子及联合应用对BMSc增殖及转化的影响，为将骨髓基质干细胞大量扩增为高效成骨细胞，为进一步研究rhBM尸一2，b「G「单独或联合应用治疗肢体延长区骨愈合提供实验依据。方法:分别以不同浓度的rhBMp一2、b「GF作用于骨髓基质细胞，检测细胞增殖情况及细胞的AL尸活性，比较rhBMp一2、bFG「的效应、同因子不同浓度的效应以及rhBM尸一2、bFG「联合应用的效应。结果:当rhBMP一2浓度在800ng/m!以下时，BMSc AL尸活性呈剂量依赖性。当rhBM尸一2浓度在800一1 20Ong/m!时，各组BMSc ALp活性无明显差别。当rhBMp一2浓度大于1200ng/ml时，BMSe ALP开始活性下降。当rh BMP一2浓度在800ng/ml以下时，各组BMSe OD值(MTT法测定，反映细胞增殖情况)无显著差异，当rhBM尸一2浓度大于800ng/m!时，BMSe OD值逐渐减小。在培养10天时，随着bFGF剂量增如，BMSe ALP值逐渐下降;当b「GF浓度在1000ng/ml以下时，随b厂G「剂量增加，各组骨髓基质细胞的00值逐渐增高，当浓度在800一1 6O0ng/ml时，各剂量00值无明显差别。rhBMp一2、b「G「联合应用能同时促进BMScALP活性和00值。结论:rhBMP一2对BMSc具有强诱导分化作用，bFGF对BMSc具有促增殖作用，二者联合应用能同时促进细胞增殖及分化。3 rhBMp一2局部注射促进兔胫骨延长区骨愈合 目的:研究rhBMP一2经皮注射到兔胫骨延长区，对于延长区骨愈合的作用。方法:日本大耳白兔42只按llizarov方法制成右侧胫骨延长模型，胫胖联合下方二次截骨，使胫骨缩短1厘米，安装自行设计的微型双臂外固定器，术后第7天开始延长，行快速延长(2次/天，lmm/次，Zmm/天)，共延长，0天，Zcm。42只兔子中，因各种原因有6只兔子被淘汰，其余 36只兔子被随机分为三组，对照组:延长区注射0.，m!醋酸盐缓冲液;H组:延长结束后?