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梭链孢烷抗生素是一类真菌来源的非羊毛甾烷型四环三萜化合物,它是以原萜烯醇（Protostadienol）为前体,通过脱去C-4β甲基,氧化C-20甲基成羧基以及C-16β位形成乙酰氧基等一系列反应形成的,其中具有代表性的梭链孢烷抗生素有三个:夫西地酸（Fusidic acid）,烟曲霉酸（Helvolic acid）,头孢菌素P1（Cephalosporin P1）。梭链孢烷抗生素具有高效的抗革兰氏阳性菌活性,其中夫西地酸已被临床上用于治疗葡萄球菌引起的各种感染,其主要通过抑制移位因子EF-G（Elongation factor G）,阻碍细菌蛋白质的合成而发挥抗菌作用。由于其作用机制特殊,与目前临床常用的抗生素无明显交叉耐药性,在全球抗生素耐药问题日趋严重的当下,发现新型梭链孢烷衍生物具有重要意义。迄今为止,研究人员利用化学衍生化以及生物转化等方法对夫西地酸的结构进行了大量改造,但至今仍未获得比夫西地酸活性更强的衍生物。组合生物合成已成为丰富天然产物结构多样性的有力手段,但其成功运用的前提是需要揭示目标化合物的生物合成途径。2009年,日本东京大学Mitsuguchi等人在烟曲霉酸高产菌株Aspergillus fumigatus Af293的基因组中发现了烟曲霉酸潜在的生物合成基因簇,该基因簇共包含有九个基因。Mitsuguchi等人利用酵母表达系统,确定了其中三个基因（helA,helB1,helC）的功能:环化酶HelA是负责催化2,3（S）-环氧鲨烯环化成原萜烯醇骨架（Protostadienol）,短链脱氢还原酶HelC是负责氧化C-3β羟基形成羰基,而P450氧化酶HelB1负责将C-4β甲基氧化成羧基。为了系统揭示烟曲霉酸的生物合成途径,本课题组吕建明博士利用米曲霉表达系统,采用一次性导入和逐步导入的方法,将之前预测的九个基因导入到米曲霉中,确定了基因簇的完整性,并首次构建了烟曲霉酸完整的生物合成途径（Nature communications,8,1644,2017）。然而,夫西地酸与头孢菌素P1的生物合成机制至今未见报道,因此本课题将在前期研究的基础上,阐明夫西地酸与头孢菌素P1的生物合成途径,从而系统揭示梭链孢烷抗生素完整的生物代谢网络。本课题首先通过从夫西地酸生产菌Acremonium fusidioides ATCC 14700以及头孢菌素P1生产菌Acremonium chrysogenum ATCC 15500的基因组中寻找环化酶helA的同源基因,分别寻找到了夫西地酸和头孢菌素P1潜在的生物合成基因簇。我们将获得的两个基因簇,与烟曲霉酸基因簇进行比较,发现这三个基因簇中均含有保守的6个基因（helA,helB1,helB2,helD2,helB4和helC）,而这保守的6个基因恰好是作用于烟曲霉酸生物合成的早期阶段。基于上述结果,我们推断梭链孢烷抗生素的生物合成早期均由保守的6基因催化完成,然后发生分支,在各自后修饰酶的作用下生成三种不同的抗生素。为了验证以上推测,我们将夫西地酸基因簇中剩下的2个后修饰基因（fusC1和fusB1）和头孢菌素P1基因簇中剩下的3个后修饰基因（cepC2,cepB4和cepD2）分别导入到前期构建好的6基因表达菌株中,结果产生了夫西地酸与头孢菌素P1,从而确认了夫西地酸与头孢菌素P1的生物合成基因簇。随后我们采用基因逐步导入,体外酶催化以及底物喂养等实验,确认了各个后修饰基因的功能并且系统地阐明了夫西地酸与头孢菌素P1的生物合成途径。在夫西地酸生物合成途径中,我们确认了短链脱氢还原酶FusC1的功能是将C-3位羰基还原成C-3α羟基,而P450氧化酶FusB1是负责氧化C-11形成C-11α羟基。有趣的是,我们在夫西地酸的生物合成基因簇中,发现两个短链脱氢还原酶FusC1和FusC2,它们能立体选择性的还原同一底物的C-3位羰基,分别形成C-3α和C-3β羟基。为了更进一步表征FusC1和FusC2体外反应的特性,我们对它们的辅因子、温度、pH进行了考察,结果发现FusC1的最适反应辅因子为NADPH,pH为7,温度为5 oC,而FusC2的最适反应辅因子为NADH,pH为7,温度为37 oC。在头孢菌素P1的生物合成途径中,我们确认了短链脱氢还原酶CepC2的功能是将C-3位羰基还原成C-3α羟基,而P450氧化酶CepB4是负责C-6和C-7的双氧化,形成C-6α羟基和C-7β羟基,另外乙酰转移酶CepD2是负责将C-6α羟基乙酰化。在研究头孢菌素P1生物合成途径中,我们发现CepB4是一个多功能的P450氧化酶,采用微粒体体外反应实验,我们证明了CepB4不仅能同时氧化C-6和C-7,还能单独氧化C-6形成C-6α羟基,并进一步氧化成羰基,也可以单独氧化C-7形成C-7β羟基。在本研究中,我们分离获得了包括终产物在内的15个梭链孢烷衍生物,其中有5个是新化合物。我们采用二倍稀释法,对分离获得的化合物进行了抗Staphylococcus aureus 209P活性评价,结果显示多数化合物呈现良好的抗金黄色葡萄球菌活性,且构效分析结果显示C-6α单羟基氧化产物能够增强化合物的抗菌活性。综上所述,本研究在烟曲霉酸六基因表达菌株基础上,首次系统地揭示了夫西地酸和头孢菌素P1的生物合成途径,为利用组合生物合成技术丰富梭链孢烷抗生素多样性,获取活性更好的梭链孢烷衍生物奠定了基础。