笑气早期用于牙科手术中作为麻醉剂使用,因吸食笑气可引起欣快感并出现幻觉,具有成瘾性,在娱乐场所得到广泛传播。笑气滥用可引起感觉异常、共济失调,严重时可导致不自主运动、排尿困难、认知障碍、记忆力下降甚至瘫痪的危险,严重威胁人们的健康。根据2016年全球药物调查显示,笑气滥用已经成为全球第七大最常用的娱乐药物。在我国,笑气滥用致神经系统疾病的新闻报道以及临床病例逐渐增多,而对于笑气毒理学作用机制还未完全阐明,因此本研究就笑气致认知障碍等神经系统损伤的作用机制进行探讨。研究目的:建立笑气（N2O）全身暴露动态吸入模型,真实模拟笑气实际吸入状态,并实现与微透析技术和电生理遥测技术的联用;通过检测大鼠吸入笑气后不同时间、不同脑区内γ-氨基丁酸、谷氨酸、多巴胺、去甲肾上腺素、乙酰胆碱的变化、血液中同型半胱氨酸的变化,以及实时监测大鼠吸入笑气前后心电、血压、体温及脑电的变化,系统地探讨吸入笑气对各神经递质在相关脑区的变化规律、相互影响,及其与脑电（认知障碍密切相关指标）等的关联性,进而推测笑气致认知障碍等神经系统损伤的作用机制,并基于该作用机制选择合适的预防药物,具此评价药物在预防给药条件下对神经递质的影响,为临床诊断和治疗提供参考;同时也是从对抗剂角度进行反向验证,最终是为更明确地阐释吸入笑气致伤提供有力的实验依据。研究方法:1.笑气全身暴露动态吸入模型的建立。为了实现与微透析技术和电生理遥测技术的联用,根据空气动力学原理自主设计了小型气体全身暴露动态吸入舱;利用高精密度的流量控制器实现对气体流速的精准控制;利用笑气浓度检测器监测暴露舱内笑气、氧气浓度,考察在不同气体流速下,不同时间、不同位置浓度的变化。2.脑区氨基酸类神经递质含量的变化。首先进行脑前额皮层区微透析植入手术,待大鼠恢复正常后,分别于30%N2O、50%N2O和70%N2O剂量下进行笑气全身暴露动态吸入实验,并采集微透析样品,连续采集26 h（吸入笑气前2 h、吸入笑气2 h、吸入笑气后22 h）的样品（每个样品收集15 min）,并利用高效液相色谱技术测定前额皮层区γ-氨基丁酸（GABA）和谷氨酸（Glu）的含量变化。3.脑区单胺类、胆碱类神经递质含量的变化。首先进行脑双位点（伏隔核区/纹状体区、前额皮层区/蓝斑区、前额皮层区/海马区）微透析植入手术,待大鼠恢复正常后,分别于30%N2O、50%N2O和70%N2O剂量下进行笑气全身暴露动态吸入实验,并采集微透析样品,连续采集26 h（吸入笑气前2 h、吸入笑气2 h、吸入笑气后22 h）的样品（每个样品收集15 min）,并利用高效液相色谱技术分别测定伏隔核区、纹状体区和前额皮层区多巴胺（DA）的含量变化、前额皮层区和蓝斑区去甲肾上腺素（NE）的含量变化以及前额皮层区和海马区乙酰胆碱（ACh）的含量变化。4.血液中同型半胱氨酸（Hcy）含量的变化。首先进行血液微透析植入手术,待大鼠恢复正常后,分别于30%N2O、50%N2O和70%N2O剂量下进行笑气全身暴露动态吸入实验,并采集微透析样品,连续采集26 h（吸入笑气前2 h、吸入笑气2 h、吸入笑气后22 h）的样品（每个样品收集15 min）,并利用高效液相色谱技术测定Hcy的含量变化。5.电生理指标的变化。首先分别进行心电、血压植入子和脑电植入子的植入手术,建立相应的电生理遥测大鼠模型,待大鼠恢复正常后,分别于30%N2O、50%N2O和70%N2O剂量下进行笑气全身暴露动态吸入实验,利用电生理遥测技术,连续6 h监测（吸入笑气前2 h、吸入笑气2 h、吸入笑气后2 h）大鼠心电、血压、体温及脑电等指标的变化。6.药物对笑气暴露致神经系统损伤的防治作用。首先分别进行脑前额皮层区微透析植入手术和血液微透析植入手术,待大鼠恢复正常,在大鼠吸入笑气前半小时分别腹腔注射地西泮和肌注甲钴胺,暴露于70%N2O剂量下进行笑气全身动态暴露吸入实验,并采集微透析样品,连续采集26 h（吸入笑气前2 h、吸入笑气2 h、吸入笑气后22 h）的样品（每个样品收集15 min）。利用高效液相色谱技术测定前额皮层区DA、NE、ACh的含量变化和血液中Hcy的含量变化,考察并探讨不同药物对吸入笑气所致认知障碍等神经系统损伤的防治作用。研究结果:1.本实验室设计的暴露舱采用有机玻璃（聚甲基丙烯酸甲酯）构建,体积小,暴露舱内笑气浓度在5 min左右即可达到平衡,且随着时间的推移,浓度均保持恒定;当笑气/氧气按照不同比例进行释放时,检测到暴露舱内4个不同位置笑气浓度均维持在平衡状态后持续保持稳定,表明可实现暴露舱内气体浓度的均一性、稳定性和可控性,并且可以满足与微透析技术和电生理遥测技术的联用。2.与吸入笑气前的基础水平相比,中、高剂量组大鼠前额皮层区GABA在吸入笑气开始15 min即出现显著性降低（P＜0.05）,在吸入笑气结束后90 min无显著性差异,恢复至正常水平;低剂量组未出现显著性变化。而在低、中、高剂量组中前额皮层区Glu均在吸入笑气开始30 min出现显著性升高（P＜0.05）,在吸入笑气结束后120 min恢复正常。3.与吸入笑气前的基础水平相比,中、高剂量组大鼠前额皮层区DA在吸入笑气开始30 min时出现显著性升高（P＜0.05）,而低剂量组在吸入笑气开始45 min出现显著变化（P＜0.05）,各剂量组均在吸入笑气结束后30 min达到最高值后逐渐下降,在吸入笑气结束120 min恢复至正常水平;伏隔核区和纹状体区DA均有类似变化规律,不同的是,中剂量组大鼠伏隔核区DA在吸入笑气结束105 min已无显著性差异;而在低剂量组中,伏隔核区DA在吸入笑气开始后75 min才出现显著变化（P＜0.05）,在吸入笑气结束90 min恢复至正常水平;纹状体区DA在染毒结束后15 min才出现显著性升高（P＜0.05）,在吸入笑气结束45 min恢复至正常水平。4.对于去甲肾上腺素而言,与吸入笑气前的基础水平相比,各剂量组大鼠前额皮层区和蓝斑区NE均在吸入笑气开始后15 min出现显著性升高（P＜0.05）,在吸入笑气结束后30 min达到最高值后逐渐下降,在吸入笑气结束135 min已无显著性差异。5.与吸入笑气前的基础水平相比,低、中、高剂量组大鼠前额皮层区ACh在吸入笑气开始后15 min时出现显著性升高（P＜0.05）,各剂量组均在吸入笑气结束后30 min达到最高值后逐渐下降,在吸入笑气结束75 min已无显著性差异;海马区ACh有类似变化规律,不同的是,低剂量组大鼠海马区ACh未出现显著性变化。6.与吸入笑气前的基础水平相比,各剂量组大鼠血液中同型半胱氨酸在吸入笑气开始后逐渐升高,低、中剂量组均在吸入笑气开始后60 min出现显著性变化（P＜0.05）,而高剂量组在吸入笑气开始后15 min即出现显著性变化（P＜0.05）,各剂量组均在吸入笑气结束后195 min出现最高值后逐渐下降,在吸入笑气结束390 min恢复正常水平。7.与空气对照组相比,中、高剂量组大鼠心率、R波、P波、T波和血压均显著性增加（P＜0.05）,QT间期和体温显著性下降（P＜0.05）。在脑电指标中,与空气对照组相比,δ波（0.5-4 Hz）未出现显著变化;θ波（4-8 Hz）在中、高剂量组显著性增加（P＜0.05）;α波（8-12 Hz）和γ波（30-48 Hz）在高剂量组均显著性下降（P＜0.05）;β波（12-30 Hz）在中、高剂量组显著性下降（P＜0.05）。大鼠各电生理指标均随笑气浓度的增加而呈剂量依赖性变化。8.与高剂量组大鼠前额皮层区各神经递质相比,地西泮预防给药组大鼠吸入笑气过程中前额皮层区DA、NE、ACh上升较缓慢;与高剂量组大鼠血液中同型半胱氨酸相比,甲钴胺预防给药组大鼠吸入笑气并未引起血液中同型半胱氨酸的升高。结论:本实验成功建立了笑气全身暴露动态吸入模型,通过与微透析技术和电生理遥测技术的联用,考察了大鼠吸入笑气后神经递质、电生理指标的变化,研究结果表明,笑气作为NMDA受体拮抗剂可引起脑内抑制性神经递质GABA的释放减少,促进Glu的释放增加,刺激激活各神经元通路,引起各兴奋性神经递质DA、NE、ACh的释放增多,引起兴奋性毒性;同时多巴胺的升高可激动交感神经,使交感神经兴奋,引起心率加快、血压升高;而乙酰胆碱释放增多可刺激大脑皮层上θ波的活动增强;GABA可通过提升α波来促进副交感神经系统,当GABA释放减少引起α波也相应出现下降;β波的降低则可能是由于NMDA受体功能减退,对感觉皮层的反馈减少造成的。Hcy的升高可能是由于笑气与维生素B12发生不可逆的反应,使同型半胱氨酸不能转化而堆积。综上所述,吸入笑气可能通过以下两种途径致认知障碍等神经系统损伤,一是笑气作为NMDA受体拮抗剂,对GABA中间神经元上的NMDA受体起抑制作用,使GABA的释放减少,抑制作用下调,促进Glu释放增加,刺激激活各神经元通路,引起各兴奋性神经递质（DA、NE、ACh）释放增多及神经兴奋,造成兴奋性毒性;同时大鼠吸入笑气后脑内多巴胺水平升高可刺激交感神经,引起交感神经兴奋,使大鼠心率加快、血压升高;而乙酰胆碱释放增多可刺激大脑皮层上θ波的活动增强;GABA可通过提升α波来促进副交感神经系统,当GABA释放减少,抑制作用下调可引起α波活动强度下降;β波的降低则是由于NMDA受体功能减退,对感觉皮层的反馈减少造成的。二是吸入笑气可使血液中同型半胱氨酸转化受阻,造成同型半胱氨酸堆积。并基于该作用机制选择可促进GABA抑制作用的药物地西泮和促进同型半胱氨酸转化的药物甲钴胺进行预防给药,结果显示药物对吸入笑气引起的神经毒性具有预防作用。