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目的:尽管有诸多研究探究ALS的发病机制及其诊治方法,但目前为止,临床上依然缺乏治疗ALS的有效策略和特异性疗法。有研究表明,服用大剂量褪黑素可以一定程度延长ALS患者的生存时间。但目前为止,褪黑素对ALS的作用依然不甚明确,相关研究也十分缺乏。本部分研究拟构建ALS小鼠模型,探究不同剂量的褪黑素对ALS小鼠生存时间及运动功能的影响。方法:研究采用SOD1*G93A转基因小鼠作为ALS模型动物,非转基因C57BL/6小鼠（野生型,WT）作为对照。ALS小鼠与WT小鼠都接受10 mg/kg、50 mg/kg及100 mg/kg的褪黑素,自动物出生后70天起以灌胃方式处理动物至小鼠死亡或至小鼠出生后180天。研究自动物出生70天后观察各组动物的基本情况、健康状态,且于70天起每周检测所有动物的体重情况。记录所有ALS动物的发病及死亡时间。所有动物自出生后70天起每周采用转棒实验检测其运动功能情况,直至其死亡或至180天。记录所有动物转棒实验潜伏时间。结果:1)所有ALS小鼠180 d内全部死亡。在180天内,未经褪黑素处理的ALS小鼠其平均生存时间为143.60±11.93天,经10、50、100 mg/kg剂量的褪黑素处理后,ALS小鼠的生存时间分别延长至151.40±8.36天、158.80±13.48天及159.30±10.02天,50及100 mg/kg的褪黑素都显著延长了ALS小鼠的生存时长。ALS小鼠的发病平均时间为99.60±4.67天,而10、50、100 mg/kg剂量的褪黑素处理后,ALS小鼠的发病时间分别为100.40±5.27、102.20±4.51及99.20±6.16天,其差异并无统计学意义。2)所有小鼠从14 w到16 w体重都逐步升高,但ALS小鼠的平均体重要低于WT小鼠。从17 w开始,所有ALS小鼠的体重开始逐步降低,至20 w降至最低值。其中未经处理的ALS小鼠体重从峰值19.17±1.25 g在第20 w降低至13.15±1.68 g。此外,褪黑素处理显著抑制了ALS小鼠从第17 w开始的体重降低程度,且其作用具有剂量依赖效应。在10、50、100 mg/kg褪黑素处理的ALS小鼠中,其第20 w体重分别为15.42±0.63 g、15.43±1.06 g、16.16±1.21 g,都显著高于未处理ALS小鼠。3)在WT小鼠中,所有动物在所有时间点的转棒实验潜伏时间都可以达到180 s而在未经处理的ALS小鼠中,自18 w开始动物的转棒实验潜伏时间随每周时间延长逐步降低。至22 w时,ALS组中的剩余动物其转棒实验潜伏时间已降至12.74±4.07 s。经不同剂量的褪黑素处理后,所有ALS小鼠的转棒实验潜伏时间在各时间点相比ALS组都有显著的升高。。结论:1.褪黑素可以呈剂量依赖性延长ALS小鼠的生存时间,但不影响其发病时间。2.褪黑素可以呈剂量依赖性改善ALS小鼠的体重减轻情况。3.褪黑素可以呈剂量依赖性改善ALS小鼠的运动功能。目的:细胞自噬在包括神经退行性疾病在内的多种疾病中发挥重要作用,研究表明在ALS疾病进展过程中,细胞自噬也存在明显的功能障碍。但目前为止,细胞自噬在ALS中的相关报道还十分有限。在本部分研究中,我们拟通过ALS小鼠模型探究ALS小鼠发病不同时期WT及ALS小鼠动物脊髓组织细胞自噬的水平,以及不同剂量褪黑素对ALS小鼠期脊髓组织细胞中SIRT1介导的细胞自噬的影响。方法:本研究采用人SOD1*G93A转基因小鼠作为ALS模型动物,非转基因C57BL/6小鼠（野生型,WT）作为对照。对照小鼠注射等量体积生理盐水。在探究褪黑素对不同时期ALS小鼠脊髓组织自噬水平的影响时,动物分组为:1)90天WT小鼠;2)90天WT小鼠+100 mg/kg褪黑素;3)90天ALS小鼠;4)90天ALS小鼠+100 mg/kg褪黑素;5)120天WT小鼠;6)120天WT小鼠+100mg/kg褪黑素;7)120天ALS小鼠;8)120天ALS小鼠+100 mg/kg褪黑素。其中,褪黑素处理组分别由各组小鼠70天起按剂量灌胃处理,至90天或120天。在探究不同剂量褪黑素对ALS小鼠脊髓组织自噬水平的影响时,动物分组为:1)120天WT小鼠;2)120天ALS小鼠;3)120天ALS小鼠+10 mg/kg;4)120天ALS小鼠+50 mg/kg;5)120天ALS小鼠+100 mg/kg褪黑素。其中,褪黑素处理组分别由各组小鼠70天起按剂量灌胃处理至120天。在探究SIRT1对ALS小鼠脊髓组织自噬水平的影响时,动物分组为:1)120天WT小鼠;2)120天ALS小鼠;3)120天ASL小鼠+100 mg/kg褪黑素;4)120天ASL小鼠+si-SIRT1;5)120天ASL小鼠+si-NC;6)120天ASL小鼠+100 mg/kg褪黑素+si-SIRT1。其中,褪黑素处理组分别由各组小鼠70天起按剂量灌胃处理至120天。si-SIRT1的处理在ALS小鼠出生后90天至120天尾静脉注射100μL上述lenti-si-SIRT1。采用RT-PCR及蛋白印迹法检测小鼠脊髓组织中自噬相关基因及蛋白beclin1、LC3 II/I、p62及SIRT1的表达。采用免疫荧光染色检测动物脊髓组织中beclin1及SIRT1的表达。结果:1)在90天时,不论WT或ALS小鼠,100 mg/kg的褪黑素均显著提高了自噬关键蛋白beclin1及SIRT1在小鼠脊髓组织的表达。相比WT小鼠,ALS小鼠的脊髓组织自噬水平在90天时要显著高于同等情况的WT小鼠,表明在发病前,ALS小鼠的脊髓组织自噬被显著激活,而褪黑素可以进一步激活其自噬水平。但在120天时,ALS组小鼠的自噬关键蛋白beclin1及SIRT1的表达显著降低,而100 mg/kg的褪黑素则可显著抑制这种降低的趋势。脊髓组织的免疫荧光结果同样表明90天时自噬关键蛋白beclin1及SIRT1在ALS及WT动物脊髓组织均升高,且褪黑素进一步提升了其表达。而120天时,ALS组脊髓组织中beclin1及SIRT1的表达极低,但褪黑素一定程度增加了其表达。2)在120天时,ALS小鼠的自噬相关蛋白SIRT1、beclin1、LC3II的表达都显著降低,而p62的表达则显著升高。在采用不同剂量的褪黑素处理后,SIRT1、beclin1、LC3II的表达都随褪黑素剂量的升高显著升高,而p62的表达则随褪黑素剂量的升高显著降低,其效果呈剂量依赖性。RT-PCR的结果同样表明,ALS动物120天时的自噬相关基因SIRT1、beclin1、LC3II的m RNA表达较WT动物显著降低,而p62的m RNA表达则显著升高。而当采用不同剂量的褪黑素处理后,自噬相关基因SIRT1、beclin1、LC3II的m RNA表达均显著升高,而p62的m RNA表达则显著降低,且效果呈剂量依赖性。3)ALS小鼠体内SIRT1、beclin1、LC3II的表达较WT小鼠都显著降低,而p62相较WT小鼠显著升高,褪黑素（100 mg/kg）处理则显著逆转了上述效果。在褪黑素处理的基础上,同时采用si-SIRT1抑制SIRT1的表达显著逆转了褪黑素对自噬蛋白SIRT1、beclin1、LC3II的促进作用及对p62的抑制作用。此外,在单独采用si-SIRT1抑制其表达而不采用褪黑素处理时,ALS小鼠体内的自噬水平被进一步降低且显著低于采用si-NC阴性对照处理的ALS小鼠。褪黑素（100 mg/kg）处理显著增加了自噬基因SIRT1、beclin1、LC3II的m RNA表达,且抑制了p62的m RNA表达,而抑制SIRT1则逆转了上述效果。结论:1.ALS小鼠90天时脊髓组织细胞自噬水平升高,而120天时自噬水平显著降低;2.褪黑素可以呈剂量依赖性的提高ALS小鼠脊髓组织细胞自噬水平;3.抑制SIRT1会逆转褪黑素对ALS小鼠脊髓组织细胞自噬水平的激活作用。目的:影响ALS发生发展的分子生物学机理目前尚不明确。其中,细胞自噬在ALS过程中扮演着重要角色。在细胞自噬过程中,一般认为SIRT1发挥了自噬激活作用,而自噬通路的激活会进一步影响诸如细胞凋亡通路、炎性通路的激活过程。但目前为止,并无研究发现SIRT1在ALS疾病进程中发挥作用。在本部分研究中,我们通过ALS动物模型,探究褪黑素通过调控SIRT1对ALS动物脊髓组织细胞凋亡及炎性因子分泌的影响。方法:本研究采用SOD1*G93A转基因小鼠作为ALS模型动物,非转基因C57BL/6小鼠（野生型,WT）作为对照。小鼠分组方案为:1)120天WT小鼠;2)120天ALS小鼠;3)120天ASL小鼠+100 mg/kg褪黑素;4)120天ASL小鼠+si-SIRT1;5)120天ASL小鼠+si-NC;6)120天ASL小鼠+100 mg/kg褪黑素+si-SIRT1。其中,褪黑素处理组分别由各组小鼠70天起按剂量灌胃处理至120天。si-SIRT1的处理采用在ALS小鼠出生后90天至120天尾静脉注射100μL lenti-si-SIRT1。采用蛋白印迹法检测凋亡相关蛋白pro-caspase-3、cleaved-capspase-3、bax、bcl-2的表达。采用酶联免疫（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）法检测动物脊髓组织IL-6、IL-1β、TNF-α表达。结果:1)在120天ALS小鼠脊髓组织中,包括被激活的cleaved-caspase-3及bax在内的促凋亡蛋白的表达都显著升高,而抗凋亡蛋白bcl-2的表达则在120天ALS小鼠脊髓组织内表达显著降低。而在100 mg/kg褪黑素处理后,相比未处理动物,ALS小鼠脊髓组织中cleaved-caspase-3及bax的表达显著降低,而抗凋亡蛋白bcl-2的表达则显著升高,抑制SIRT1则显著抑制了褪黑素对凋亡蛋白的抑制作用。2)在120天的ALS小鼠脊髓组织中,炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α的表达相对WT小鼠显著升高。在采用100 mg/kg的褪黑素处理后,ALS小鼠脊髓组织中炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α的表达显著降低了。然而在采用si-SIRT1抑制其表达后,抑制SIRT1显著逆转了褪黑素对炎性因子分泌的抑制作用。结论:1.ALS小鼠脊髓组织中的凋亡通路被激活而炎性因子分泌水平显著升高;2.褪黑素可以显著抑制ALS小鼠脊髓组织中的凋亡通路和炎性因子分泌;3.抑制SIRT1的表达可以逆转褪黑素对ALS小鼠脊髓组织中的凋亡通路和炎性因子分泌的抑制作用。