镉(cadmium,Cd)作为一种严重危害公共健康安全的重金属污染物,广泛存在于环境中,且不易降解,可使多种组织损伤甚至癌变。其中肾脏作为机体重要的排泄器官,对镉的毒性极为敏感,不同剂量、时间均会导致肾脏出现不同程度的损伤。异荭草素(isoorientin,ISO)是一种具有抗氧化、抗病毒等作用的天然植物提取成分。DNA氧化损伤是由各种刺激导致细胞出现氧化性反应并诱导DNA损伤的过程。周期阻滞是细胞为应对DNA损伤的反应程序。本研究在体外模型建立的基础上,研究了镉致肾小管上皮细胞DNA氧化损伤及细胞周期的变化,同时探究异荭草素的保护效应。1.镉对大鼠肾小管上皮细胞DNA氧化损伤的影响选择大鼠肾小管上皮细胞系NRK-52E及原代细胞(Rat renal tubular cell,rPT细胞)为研究对象,在培养过程中用不同浓度镉(0、1.25、2.5、5 μmol/L)处理12 h后进行以下试验:(1)透射电镜观察细胞核的形态;(2)Western-blot、免疫荧光技术检测DNA损伤标志性蛋白H2AX的磷酸化水平;(3)流式细胞术和ELISA试剂盒分别检测ROS及8-OHdG的表达量。结果表明,与对照组相比,(1)镉组细胞核出现了明显损伤变化,表现为细胞核的变形损伤;(2)镉组p-H2AX的表达量显著性升高(P<0.01),并出现明显的彗星状拖尾现象;(3)镉组ROS及8-OHdG含量显著性升高(P<0.01),且具有浓度依赖性。表明镉可以引起大鼠肾小管上皮细胞DNA损伤,这种损伤与氧化应激有关。2.镉对大鼠肾小管上皮细胞周期分布的影响以NRK-52E及rPT细胞为研究对象,进行以下试验:(1)不同浓度镉(0、1.25、2.5、5μmol/L)处理12h后,流式细胞术检测细胞周期的分布,Western-blot检测p53、p21及细胞周期相关调控蛋白表达的变化;(2)添加20 μmol/L p53抑制剂(Pifithrin-α,PFT-α)与2.5 μmol/L镉单独或联合处理后,Western-blot检测p53、p21及相关周期蛋白的表达。结果表明:(1)与对照组相比,镉处理组细胞在G1期分布数量极显著增多(P<0.01),一定范围内具有浓度依赖性;与对照组相比,2.5、5 μmol/L镉组p53、p21蛋白表达量显著性升高(P<0.01),Cyclin D1、CDK4 及 Cyclin E1、CDK2 的表达量极显著性下降(P<0.01);(3)与镉组相比,PFT-α与镉共处理组p53、p21蛋白表达量显著性下降(P<0.01),Cyclin D1、CDK4及Cyclin E1、CDK2的表达量极显著性升高(P<0.01)。表明镉可通过p53依赖途径诱导G1期周期阻滞。3.异荭草素在镉对大鼠肾小管上皮细胞损伤中的保护作用以NRK-52E细胞为研究对象,通过CCK-8和RTCA法检测不同浓度异荭草素对细胞活性的影响,最终选用80 μmol/L异荭草素进行后续研究。2.5 μmol/L镉单独或与80 μmol/L异荭草素联合处理大鼠肾小管上皮细胞12 h后,利用透射电子显微镜和单细胞凝胶电泳技术观察细胞核形态学变化及细胞核DNA损伤、采用流式细胞术和ELISA法检测ROS和8-OHdG含量、采用蛋白免疫印迹法和免疫荧光法检测p-H2AX蛋白表达水平、利用流式细胞术和蛋白免疫印迹法检测细胞周期分布情况以及周期相关蛋白表达。结果显示:与镉单独处理组相比,异荭草素与镉共处理组:(1)细胞核形态趋于规则、DNA损伤减轻、彗星拖尾变短;(2)ROS和8-OHdG水平均极显著降低(P<0.01);(3)p-H2AX蛋白表达量极显著降低(P<0.01);(4)处于G0/G1期的细胞数量极显著减少(P<0.01)、p53和p21蛋白表达极显著降低(P<0.01),同时Cyclin D1、CDK4、Cyclin E1和CDK2蛋白表达显著升高(P<0.05)。以上结果表明,异荭草素可以通过增强抗氧化能力缓解镉导致的肾小管上皮细胞DNA氧化损伤及周期阻滞。结论,镉致氧化应激引起大鼠肾小管上皮细胞DNA损伤,并通过p53依赖途径使得细胞周期阻滞在G1期。异荭草素可以通过其抗氧化性缓解镉引起的大鼠肾小管上皮细胞DNA氧化损伤,并使得细胞周期G1期阻滞得到缓解。