肝癌是世界上公认的高致死率的恶性癌症之一,早期症状不明显,晚期治疗方式十分有限且预后极差。索拉非尼（Sorafenib）是当前被批准用于肝癌治疗的一线口服用药,但患者耐受反应严重影响药物疗效。CRISPR/Cas9基因编辑系统可以选择性靶向耐药相关基因,克服癌症治疗中耐药问题;然而,安全、高效和肿瘤细胞特异性CRISPR系统递送平台尚待开发。研究显示,由细胞膜出芽生成的微囊泡（Microvesicles,MVs）,可在细胞间传递活性生物分子,参与细胞间通讯,是天然的药物递送载体,可能成为细胞治疗的重要辅助工具。因此,本文的研究旨在将微囊泡作为CRISPR/Cas9的天然递送平台,联合索拉非尼常规治疗,通过靶向耐药机制实现更好的协同抗癌效果,主要取得如下创新性成果:1.研究不同细胞分泌MVs的特性,发现肿瘤来源MVs对肿瘤组织具有天然的趋向性,携带并传递肿瘤相关分子介导肝癌细胞索拉非尼耐药,促进肿瘤发展;工程HEK293分泌MVs可作为合适的纳米载体,可以运输CRISPR系统至靶细胞并介导有效基因编辑。2.建立了工程化微囊泡用于靶向递送CRISPR系统的方法。首先,使工程HEK293细胞稳定表达Cas9,通过内源化载药的方式获得携带Cas9的微囊泡（Cas9MVs）;然后,再次工程化该HEK293生成正常供体细胞来源的表达HN3微囊泡（HN3LC9-293MVs）,具有肝癌细胞特异性靶向性,并且可以运输sgRNA至靶细胞并介导有效基因编辑。研究结果显示,HN3LC9-293MVs在体外被受体肝癌细胞迅速吸收;通过融合LAMP2蛋白,HN3抗体被锚定在微囊泡膜上,使HN3LC9-293MVs在共培养模型中特异性地进入GPC3阳性Huh7肝癌细胞而不是GPC3阴性LO2正常人肝细胞,该结果进一步支持了HN3LC9-293MVs对肝癌细胞的特异靶向性。3.应用上述工程化微囊泡实现对索拉非尼耐药机制的靶向编辑与调控,有效缓解肝癌细胞索拉非尼耐药,同时清除肿瘤干细胞,联合索拉非尼药物治疗取得协同杀伤肿瘤效应。研究结果表明:敲除参与调控索拉非尼耐药过程中激活的PI3k/Akt信号通路的IQGAP1,增强肿瘤对索拉非尼的敏感性。同时,考虑到肿瘤干细胞（CSCs）作为具有自我更新能力的肿瘤细胞亚群,是癌症治疗中药物耐受的原因之一;因此,我们利用电转染外源性载药方式将构建的双向导RNA质粒（sgIQ1.1/FOXM1.2）封装到上述工程化微囊泡中,介导编辑IQGAP1和FOXM1（参与癌症干细胞的自我更新干性调控,导致索拉非尼耐药）基因。我们的研究数据同时证明,IQGAP1和FOXM1基因抑制导致CD133阳性肿瘤干细胞减少。此外,将装载sgIQ 1.1/FOXM 1.2的HN3LC9-293MVs与索拉非尼联合使用,在肝癌细胞中表现出更有效的协同抗增殖和促凋亡疗效作用。综上,本文研究通过工程化微囊泡递送CRISPR/Cas9介导耐药相关基因编辑用于改善索拉非尼耐药同时可以清除肿瘤干细胞。我们的研究预示了更好、安全、天然的递送系统,为未来精准有效的癌症治疗提供了新的思路和有力工具。