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一、研究目的
系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus,SLE)是一种多见于中青年女性的自身免疫性疾病,显著特征是血清中存在大量的自身抗体,并经常累及多个器官,往往是症状加重与缓解交替出现,常因肾功能衰竭或继发感染等原因死亡。皮肤损害是各型红斑狼疮最常见、最早出现的症状之一,并随着疾病的变化而加重或减轻。而且在疾病的不同时期、不同阶段,皮疹呈现不同的肉眼特点和病理特点。因此,长期以来较多的学者把红斑狼疮的皮肤损害研究作为研究的热点。SLE的确切发病机制还不清楚,能够用于早期诊断或决策治疗的生物标记也十分有限。本研究利用蛋白质组学技术高通量发现正常皮肤和SLE皮损之间表达的差异蛋白,并对其表达进行验证。从整体水平寻找SLE皮损致病相关蛋白,筛选系统性红斑狼疮皮损表达的分子标记物,为探索其发病机理、疾病诊断和分型和治疗提供有益的线索。
二、研究方法
1.收集临床表现、实验室检查、普通病理和免疫病理证实的SLE患者,选取年龄、性别类似志愿者作为对照组,活检取皮损和正常皮肤后原代扩大培养角质形成细胞。
2.以裂解液成分、上样量的选择和等电聚焦参数为侧重点,通过比较分析不同条件下电泳图谱,建立和优化人角质形成细胞蛋白质双向电泳技术。
3.运用双向电泳—质谱—生物信息学为核心的蛋白组学技术,分析10例SLE皮损和正常皮肤角质形成细胞总蛋白的肽质量指纹图谱,鉴定差异表达蛋白。
4.选取鉴定其中的一些关键蛋白进行免疫组化和免疫印迹表达验证,评估其在正常组织和SLE皮损中的表达情况。
三、研究结果
1.两步消化法和体外无血清培养能够很好地分离表皮与真皮,活细胞率高,而且可以在体外快速稳定增殖,是一种理想的皮肤角质形成细胞分离培养的方法。
2.成功建立了人角质形成细胞总蛋白制备方法,优化了人角质形成细胞双相电泳技术,获得了重复性和分辫率都较理想的角质细胞总蛋白质双向电泳图谱。
3.系统性红斑狼疮皮损和正常皮肤电泳图谱平均蛋白质点分别为1475±26和1338±19,平均匹配点数为1196±14和1125±17,匹配率为81.08%和84.08%。差异蛋白质25个,19个在皮损高表达,6个在皮损组低表达,有4个点仅在病例组表达,2个点仅在正常对照组表达。
4.对表达上调的蛋白质斑点进行质谱分析,经数据库检索,初步鉴定在SLE皮损中表达上调的蛋白是:Heat shock70-kDa protein1,keratin2e,keratin5,keratin6,keratin14,keratin16,Myxovirus resistance protein1,Heat shock90-kDa protein1,SCCA1,SCCA2,IFIT4,skin aspartic protease,t—complex polypeptide1,Involucrin,Annexin1。在SLE皮损表达下调的蛋白是:keratin1,keratin10,Phospholipase C beta1。
5.免疫组化结果显示,SLE皮损中,K1/10和K2e位于表皮上层,前者表达减弱而后者表达增强。K5/14和Involucin位于表皮下层,均表达增强。K6/16表皮全层均强表达,与正常皮肤比较,具有显著性差异。免疫印迹显示,在SLE皮损角质细胞中,HSP90、SCCA1、MXA和Annexin1有高表达,与双向电泳和质谱分析结果一致。
四、结论
体外成功无血清培养了人角质形成细胞并建立和优化了双向电泳研究平台,获得了重复性和分辨率都较好的蛋白质组双向电泳图谱。双向凝胶电泳结合质谱分析这两项蛋白质组学技术可以用于分析SLE皮损临床标本中的差异表达蛋白质。对这些标记蛋白质的进一步研究,可能为SLE的发病机制、早期诊断和治疗提供重要信息。