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目的:研究缺氧诱导人肾小管上皮(HK2)细胞产生的细胞外囊泡(EVs)中microRNA(miRNA)表达量的变化,探索缺氧诱导HK2细胞来源的EVs中miRNA减轻肾脏缺血再灌注损伤(IRI)的具体机制。方法:1.将HK2细胞分泌的EVs用超高速离心的方法进行提取,用电镜、粒径分析,以及Western blot技术对EVs进行鉴定;此外,将C57BL/6小鼠分成4组分别为假手术(SHAM)组、IRI+磷酸缓冲盐溶液(PBS)组、IRI+常氧状态下HK2细胞分泌的细胞外囊泡(NOR-EVs)组及IRI+缺氧状态下HK2细胞分泌的细胞外囊泡(HYP-EVs)组。使用过碘酸雪夫氏(PAS)染色法,肾小管损伤评分法以及血肌酐值测定法来评估不同处理组中肾脏组织的损伤程度。2.结合高通量测序结果,提取常氧和缺氧状态下EVs中miRNA并进行RT-PCR验证,选取在缺氧条件下表达量提高的miRNA并进行生信学分析,找到靶基因。3.用miRNA-125-5p mimics(miR-MI)和microRNA negative control(miR-NC)分别转染HK2细胞,RT-PCR分别检测细胞及其分泌的EVs中miRNA-125b-5p的表达量;另外对转染过miR-MI和miR-NC的HK2细胞中NLRC5的mRNA和蛋白含量用RT-PCR和Western blot技术分别进行检测,同时用双荧光素酶报告基因技术对miRNA-125b-5p和NLRC5之间的靶向关系进行进一步验证。4.将C57BL/6小鼠分成4组分别为SHAM组、IRI+PBS组、IRI+miR-NC转染HK2细胞分泌的EVs(NC-EVs)组及IRI+miR-MI转染HK2细胞分泌的EVs(MI-EVs)组。用PAS染色法,肾小管损伤评分法以及血肌酐值测定法来评估不同处理组中肾脏组织的损伤程度,同时对各组肾脏组织中的NLRC5含量进行免疫组化鉴定。结果:1.电镜、粒径分析、Western blot技术鉴定后,符合EVs表型特征;PAS染色,肾小管损伤评分以及血肌酐的测定均可发现对比与IRI+PBS组,EVs组均可明显改善肾脏IRI程度,且以IRI+HYP-EVs改善效果最为明显。2.RT-PCR结果显示:结合高通量测序结果,对比常氧条件下,缺氧条件下EVs中有4个miRNA明显上调;生信学分析发现miRNA-125-5p及NLRC5均和肾脏IRI的PI3K-AKT通路密切相关,且miRNA-125-5p与NLRC5 3’非编码区域(UTR)有结合位点。3.对比miR-NC转染的HK2细胞,miR-MI转染后,RT-PCR检测发现miRNA-125-5p在HK2细胞及其分泌的EVs中均明显上调;与此同时,RT-PCR和Western blot检测发现细胞中NLRC5表达量也同时下降,双荧光素报告基因实验表明miRNA-125-5p能与NLRC5靶向结合。4.PAS染色,肾小管损伤评分以及血肌酐的检测均可发现对比与IRI+PBS组,EVs可明显改善肾脏IRI程度,且以IRI+MI-EVs组改善效果最为明显。免疫组化结果发现对比与IRI+PBS组,EVs处理之后的肾脏组织中NLRC5含量明显下降且以IRI+MI-EVs组效果为著。结论:缺氧诱导下HK2细胞产生的EVs中miRNA-125b-5p可明显上调,且miRNA-125b-5p可以通过靶向负调控NLRC5从而发挥其对肾脏IRI的保护作用。