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乙肝是一种发病率极高、容易诱发肝硬化和肝癌的常见疾病,它严重威胁人类的身心健康,给患者家庭和社会带来极大负担,然而当前安全、有效的治疗药物相当缺乏。中药治疗乙肝具有多靶点、多途径、多层次协同作用和毒副作用小的优势,它可以通过增强免疫、抗乙肝病毒、改善肝功能、保护肝细胞等途径发挥重要作用,因此从中药中发现治疗乙肝的药物为该病的治疗提供新途径。复方虎杖方全方由虎杖、五味子、垂盆草等七味中药组成,具有清肝利胆之功效,临床上用于病毒性肝炎引起的肝胆湿热诸症。该方在江苏省中西医结合医院临床使用近30余年,是安全性较好、临床疗效确切的有效方剂。前期研究表明,复方虎杖方在体外能有效地抑制HBsAg、HBeAg和HBV DNA复制,具有较好的抗乙肝作用。但是由于该方在体内发挥药效作用的基础的物质不清楚,严重地制约了将其开发成剂型先进、质量可控的治疗乙肝的临床药物。故本研究拟沿着“体外成分-入血成分-入细胞成分-活性成分”轴逐层推进的策略,展开关于复方虎杖方的药效物质基础的实验研究,具体研究内容包括以下五部分:1提取工艺研究复方虎杖方组成药味较多,化学成分复杂,由许多成分协同发挥药效,因此在选择提取工艺评价指标时仅以一个或几个指标成分远远不够。本研究采用指纹图谱与主成分分析相结合的方法,对复方虎杖方乙醇提取工艺进行优化。实验中运用HPLC法建立复方的全息指纹图谱,对共有峰峰面积进行数据统计学主成分分析,以总因子得分为评估指标,采用U9（93×31）均匀设计法考察不同的乙醇用量、乙醇浓度、提取时间和提取次数对提取的效果影响,然后建立统计学回归数理模型,确定最佳提取工艺参数。所建立的数学模型能够较好的描述效应指标与各因素之间的关系,本次实验中应用建立的方法优化得到复方虎杖方最适宜提取工艺参数为加6倍量90%乙醇提取3次,每次1 h。实验结果表明该方法能全面提取复方虎杖的有效成分,对复方中药复杂成分提取工艺优化有一定的参考价值。2体外化学成分分析复方虎杖方具有较好的抗乙肝作用,但物质基础不清楚,本研究应用UPLC-Q-TOF/MS液质联用技术,通过获得色谱峰的准分子离子峰,对其醇提液的化学成分进行分析。实验中,采用正负离子模式结合分析,依据各色谱峰在质谱中的精确分子量、质谱裂解规律、碎片信息和色谱保留规律,并结合相应对照品的质谱信息、参考文献,归属并推断87个化合物,主要成分包括蒽醌类、二苯乙烯类、生物碱类、木脂素类等。在这87个化合物中,25个成分来源于虎杖,25个来源于黄柏,16个来源于金钱草,17个来源于茵陈,9个成分来源于五味子,4个来源于垂盆草,2个来源于青黛。实验结果为进一步体内入血成分分析奠定基础。3入血化学成分分析复方虎杖方提取物含有较多的化学成分,但只有吸收进入体内才有可能发挥药效。因此,分析入血成分是研究该方药效物质基础的重要一环。本研究将复方虎杖方提取物给予大鼠灌胃后,采集空白血清与含药血清对比的方法,运用UPLC-Q-TOF/MS液质联用技术,采集正负模式下的提取离子流图以及各色谱峰的准分子离子峰。结合已经鉴定的复方虎杖方的体外化学成分信息以及文献中报道的裂解途径,运用MetaboLynx XSTM数据处理软件推断含药血清中23个相关代谢产物的质谱信息,其中包括17个原型成分和6个新代谢物,为进一步入细胞成分分析奠定基础。4入细胞化学成分分析复方虎杖方进入体内的化合物及其代谢产物相对于服用之前精简了不少,但最终发挥作用的化合物应该是直接作用的靶细胞。本研究运用大鼠含药血清与HepG2.2.15细胞共孵育,同时设置空白血清对照组以扣除背景差异,收集细胞裂解液,采用UPLC-Q-TOF/MS液质联用技术对HepG2.2.15细胞亲和后胞内化学成分进行定性分析,结果在复方虎杖方亲和的HepG2.2.15细胞裂解液中共鉴定三个化合物,分别为小檗碱、五味子醇甲、五味子甲素,初步推断为复方虎杖方中的可能活性成分。5抗乙肝作用活性验证为了验证复方虎杖方进入细胞的三种化合物是否为有效成分,本研究采用MTT比色法评价小檗碱、五味子醇甲、五味子甲素对转染HBV病毒的人肝癌细胞（HepG2.2.15细胞）的活性及强度。结果表明,小檗碱、五味子醇甲、五味子甲素对HepG2.2.15细胞均具有一定的抑制细胞增殖的活性,且活性强度优于阳性药拉米夫定。在2.5μmol.L-1320μmol.L-1浓度范围内,三种化合物对抑制细胞增殖作用呈现明显的剂量依赖关系,对HepG2.2.15细胞株的IC50分别为70.85μmol.L-1,152.80μmol.L-1,167.80μmol.L-1。综上所述,本研究首先采用指纹图谱与主成分分析相结合的方法对复方虎杖方的提取工艺进行了优化,确定了最适宜提取工艺参数;接着应用UPLC-Q-TOF/MS技术表征了体外化学成分、入血化学成分、入细胞化学成分;最后应用转染HBV基因的HepG2.2.15细胞模型对进入细胞的化学成分进行了活性验证,初步确定了该方治疗乙肝的药效物质基础,为将其开发成防治乙肝的药物奠定了坚实的基础。