论文部分内容阅读
原发性肝癌是我国最常见且恶性程度最高的肿瘤之一,远隔器官转移是肝癌患者致死率高的主要原因。肿瘤细胞与肿瘤微环境黏附能力的改变是导致肿瘤细胞迁移和侵袭能力增加进而促进肿瘤细胞向远隔器官转移的始动和关键因素。肿瘤细胞首先通过膜表面受体如整合素(integrin)与细胞外基质成分如纤连蛋白(Fibronectin,FN)、层粘连蛋白(Laminin,LN)、胶原蛋白(Collagen,COL)的黏附,诱导肿瘤细胞及基质细胞释放蛋白酶降解基底膜和基质,促使肿瘤细胞经血道和淋巴道转移。因此,从分子水平研究肝癌黏附机制,探寻黏附相关因子的表达调控规律,并针对此寻找有效的早期诊断指标及治疗措施将可能为肝癌的治疗提供新的思路和方法。
蛋白质糖基化是真核生物体内重要的翻译后修饰方式,其在恶性肿瘤的演变过程发挥重要作用。唾液酸化(sialylation)作为一种糖基化形式,主要包括α2,3-,α2,6-,α2,8-三种连接方式。唾液酰基转移酶β-galactoside:α2-6-sialyltransferase1(ST6Gal-Ⅰ)是催化唾液酸以α2,6-糖苷键与N-聚糖最外侧Galβ1-4GlcNAc二糖单位中Gal连接的关键酶,形成α2,6连接唾液酸(α2,6-linked sialic acid)结构。由于唾液酸本身带负电荷的特性及所处聚糖链最外侧的位置特点,决定肿瘤细胞表面唾液酸化改变参与调控肿瘤恶性行为。有证据表明,ST6Gal-Ⅰ及其催化产物α2,6连接唾液酸在包括结肠癌、乳腺癌、胃癌等癌组织中表达上调,而且正向调控癌细胞的抗凋亡,促血管生成以及转移能力。研究发现,ST6Gal-Ⅰ及α2,6连接唾液酸水平在肝癌组织中较慢性肝疾病及正常肝组织中明显增加,然而其上调的调控机制及在肝癌进展中发挥的作用还不明确。
窖蛋白-1(caveolin-1,Cav-1)是胞膜窖的主要结构和功能成分,参与调控胆固醇转运、细胞内吞、信号转导以及肿瘤的恶性行为。已有研究表明,Cav-1促进肝癌细胞的恶性转化、抗凋亡和转移等能力,在肝癌中发挥癌基因样作用。我们实验室前期研究发现,Cav-1通过上调基质金属蛋白酶诱导剂CD147的N-聚糖水平,从而诱导基质金属蛋白酶的分泌,进一步促进小鼠肝癌细胞的迁移和侵袭。有证据显示,Cav-1能够介导糖基转移酶N-acetylglucosaminyltransferase Ⅲ(GnTⅢ)在人肝癌细胞Huh6中的高尔基体定位。此外,Cav-1参与活化Wnt/beta-catenin信号通路,而活化的Wnt/beta-catenin信号能够启动糖基转移酶基因DPAGT1的表达。因此,Cav-1有可能对糖基化修饰发挥重要的调控作用。
本文以不同淋巴道转移能力的小鼠肝癌Hepa1-6细胞(无淋巴道转移潜能)、Hca-F细胞(高淋巴道转移潜能)和H22细胞(高淋巴道转移潜能)等为研究对象,应用分子克隆、基因转染、RNA干扰等技术。
1)阐明Cav-1对ST6Gal-Ⅰ表达的调控作用;
2)分析Cav-1及ST6Gal-Ⅰ对细胞与细胞外基质及淋巴结黏附的影响;
3)探讨ST6Gal-Ⅰ介导细胞与细胞外基质及淋巴结黏附的分子机制。
本研究实验结果如下:
1.Cav-1对小鼠肝癌细胞ST6Gal-Ⅰ表达的调控
(1)分析Cav-1及三种唾液酰基转移酶在小鼠肝癌细胞Hca-F和Hepa1-6中的表达
1)Real-time PCR结果显示:Hca-F细胞高表达Cav-1及ST6Gal-Ⅰ,Hepa1-6细胞未检测到Cav-1表达并低表达ST6Gal-Ⅰ,两种细胞的ST3Gal-Ⅰ及ST6Gal-Ⅱ的表达丰度没有明显差别;
2)Western blot检测到的两种细胞内Cav-1及ST6Gal-Ⅰ的表达趋势与Real-time PCR结果基本一致;
3)SNA凝集素能够特异性识别ST6Gal-Ⅰ的催化产物,即α2,6连接唾液酸结构,SNA凝集素印记结果显示:Hca-F细胞的α2,6连接唾液酸水平明显高于Hepa1-6细胞。
(2)过表达Cav-1上调Hepa1-6细胞的ST6Gal-Ⅰ表达
1) Real-time PCR和Western blot结果显示:稳定表达Cav-1的Hepa1-6细胞(Hepa1-6/Cav-1,Cav-1)与转染空载体的Hepa1-6细胞(Mock)相比,ST6Gal-Ⅰ的表达明显增加,ST6Gal-Ⅰ特异性siRNAs(ST6Gal-Ⅰ-siRNAs)能够显著下调Hepa1-6/Cav-1细胞的ST6Gal-Ⅰ表达;
2)SNA凝集素印记结果显示:Cav-1的稳定表达上调了Hepa1-6细胞的α2,6连接唾液酸水平,其能够被ST6Gal-Ⅰ-siRNAs所抑制。
(3)Cav-1沉默下调了Hca-F细胞的ST6Gal-Ⅰ表达,其能够被野生型Cav-1及ST6Gal-Ⅰ的重新引入所恢复
1)将Cav-1特异性短发夹RNA(shRNA)干扰载体(shCav-1-1、shCav-1-2和shCav-1-3)分别转染Hca-F细胞,Real-time PCR及Western blot结果显示:与阴性对照(shNC)相比,三种干扰载体中,以shCav-1-1下调Cav-1的效果最明显,同时对ST6Gal表达的抑制作用也最显著,shCav-1-1对ST6Gal-Ⅰ的抑制能够被野生型Cav-1及ST6Gal-Ⅰ的重新引入所恢复;
2)SNA凝集素印记结果显示:shCav-1-1的转染明显下调了Hca-F细胞的α2,6连接唾液酸水平,其能够被野生型Cav-1及ST6Gal-Ⅰ的转染所逆转。
(4)Cav-1通过其绞手架结构域(CSD)上调ST6Gal-Ⅰ表达
利用Cav-1绞手架结构域突变体(△CSD)及Cav-1第133、143、156位棕榈酰化突变体(△C133,143,156A)分别转染Cav-1沉默的Hca-F细胞,Real-timePCR、Western blot及SNA凝集素印记结果显示:△C133,143,156A能够营救ST6Gal-Ⅰ表达及α2,6连接唾液酸水平,而△CSD不能发挥上述作用。
(5)Cav-1通过诱导ST6Gal-Ⅰ启动子活性促进H22细胞的ST6Gal-Ⅰ表达
1)将shCav-1-1、shCav-1-2和shCav-1-3三种干扰载体分别转染H22细胞,Real-time PCR、Western blot结果显示,三种干扰载体中以shCav-1-1对Cav-1的沉默效果最明显,同时对ST6Gal-Ⅰ表达的抑制也最显著,shCav-1-1对ST6Gal-Ⅰ的抑制作用能够被野生型Cav-1及ST6Gal-Ⅰ的重新引入所恢复;
2)利用UCSCGenome Browser(http://genome.ucsc.edu)获得ST6Gal-Ⅰ的启动子区,并构建重组荧光素酶报告载体pGL3-basic/ST6Gal-Ⅰ。荧光素酶活性检测结果显示:三种Cav-1干扰载体分别转染H22细胞后,减弱了ST6Gal-Ⅰ启动子控制的荧光素酶活性,以shCav-1-1的抑制效果最显著,其能够被野生型Cav-1的营救所逆转。
2.Cav-1、ST6Gal-Ⅰ对小鼠肝癌细胞与细胞外基质及淋巴结黏附的影响
(1)检测小鼠肝癌Hca-F和Hepa1-6细胞与FN、COL及LN的黏附
体外细胞黏附结果显示:Hca-F细胞与细胞外基质主要成分FN、COL、LN的黏附能力明显高于Hepa1-6细胞。
(2) Cav-1过表达上调Hepa1-6细胞与FN的黏附及FAK信号,其能够被ST6Gal-Ⅰ的下调所抑制
体外细胞黏附及Western blot结果显示:与Mock转染相比,Cav-1的转染显著上调了Hepa1-6细胞与FN的黏附及黏附信号分子FAK的磷酸化水平,其能够被ST6Gal-Ⅰ-siRNAs所抑制,而且Cav-1过表达没有影响Hepa1-6细胞与COL或LN的黏附。
(3)下调Cav-1表达抑制Hca-F细胞与FN的黏附及FAK信号,其能够被野生型Cav-1或ST6Gal-Ⅰ的重新引入所恢复
体外细胞黏附及Western blot结果显示:与shNC相比,Cav-1沉默减少了Hca-F细胞与FN的黏附及磷酸化FAK水平,其能够被野生型Cav-1及ST6Gal-Ⅰ的转染所营救,Cav-1表达下调没有影响Hca-F细胞与COL或LN的黏附。
(4)下调ST6Gal-Ⅰ表达抑制Hca-F细胞与淋巴结的黏附
体外及体内淋巴结黏附结果显示:ST6Gal-Ⅰ-siRNAs的转染显著减少了Hca-F细胞与淋巴结的黏附。
3.ST6Gal-Ⅰ调控小鼠肝癌细胞与细胞外基质及淋巴结黏附的分子机制
(1) Cav-1上调H22细胞表面α2,6连接唾液酸水平,细胞表面α2,6唾液酸化促进了H22细胞与FN的黏附及FAK信号的活化
1) SNA凝集素印记和流式细胞技术结果显示:Cav-1特异性shRNA的转染减少了H22细胞表面α2,6连接唾液酸水平,其能够被野生型Cav-1及ST6Gal-Ⅰ的转染所恢复;
2)体外细胞黏附结果显示:Cav-1沉默抑制了H22细胞与FN的黏附,其能够被野生型ST6Gal-Ⅰ的引入所恢复,Cav-1沉默没有影响H22细胞与COL或LN的黏附;
3) Western blot结果显示:Cav-1下调抑制了H22细胞的FAK和Paxillin磷酸化,野生型Cav-1及ST6Gal-Ⅰ的转染逆转了上述变化。
(2)α5-integrin的α2,6唾液酸化介导了H22细胞与FN的黏附
1)免疫沉淀结果显示:Cav-1沉默下调了H22细胞表面α5-integrin的α2,6唾液酸化水平,其能够被野生型Cav-1及ST6Gal-Ⅰ的重新引入所恢复;
2)Westernblot和流式细胞技术结果显示:Cav-1和ST6Gal-Ⅰ没有影响H22细胞表面integrinα5β1的表达;
3)体外细胞黏附的功能性抗体阻断结果显示:与ST6Gal-Ⅰ营救的Cav-1沉默细胞相比,Cav-1沉默细胞与FN的黏附更容易被抗-α5或抗-β1整合素抗体所阻断。
(3)α2,6连接唾液酸与CD22的识别介导Hca-F细胞与淋巴结黏附
1)体外细胞黏附结果显示:与Control-siRNA的转染相比,ST6Gal-Ⅰ-siRNAs明显抑制了Hca-F细胞与CD22的黏附;
2)体外淋巴结黏附的功能性抗体阻断结果显示:在不同浓度的抗-CD22抗体作用下,与对应的Control-siRNA转染细胞相比,ST6Gal-Ⅰ-siRNAs转染的Hca-F细胞与淋巴结的黏附更容易被抗体阻断。
结论:
1.Cav-1在转录水平促进小鼠肝癌细胞的ST6Gal-Ⅰ表达,Cav-1的CSD区参与该调控过程;
2.Cav-1诱导的ST6Gal-Ⅰ表达介导了小鼠肝癌细胞与FN及淋巴结的黏附;
3.小鼠肝癌细胞表面α5-integrin的α2,6连接唾液酸化介导了integrinα5β1依赖的细胞黏附及FAK信号,α2,6连接唾液酸与CD22的识别参与小鼠肝癌细胞与淋巴结的黏附。