于单个细胞水平探讨生命活动过程中蛋白质的功能化学基础是近年来的研究热点问题。单细胞蛋白质分析实现在单细胞水平上进行蛋白质丰度的检测,从而促进疾病发生发展基本机制研究和药物治疗方案研究。单细胞质谱流式细胞术是新一代的多参数检测流式细胞仪,可实现单细胞水平的不同复杂细胞亚群的表面分子及功能状态定性和定量的同时检测。检测通道数量显著增加,分辨率高,背景低,无需补偿,实验流程简化,在免疫学研究领域发挥着重要的作用。完善该项新兴技术的样本前处理方法并确立标准数据分析流程具有重要的理论和现实意义。免疫印迹术是研究细胞和组织中目的蛋白的表达水平的常见方法,是分子生物学、生物化学、遗传免疫学学科领域内广泛应用的技术,是诸多疾病如艾滋病诊断的金标准。单细胞免疫印迹术将微流控技术与传统免疫印迹术相结合,可单细胞水平地、高特异性地研究复杂细胞群体的表面蛋白、跨膜蛋白、胞内及核内的蛋白,在药物筛选、细胞异质性研究等方面具有重要的应用价值。单细胞免疫印迹术所需样本细胞量大,灵敏度受限于凝胶的光敏固定蛋白质的能力,在稀有细胞样本的单细胞低丰度蛋白质研究方面遇到严重挑战。本论文旨在建立并完善单细胞质谱流式细胞术及单细胞免疫印迹术,并将这两种单细胞蛋白质检测技术应用于肿瘤免疫及肿瘤异质性的研究。首先建立单细胞质谱流式细胞术分析外周血免疫细胞族群的方法,实现肿瘤发生、发展过程中肿瘤患者外周血免疫细胞免疫检查点分子表达图谱的绘制。再以凝胶电泳用分离介质材料的开发为切入点,通过合成基于四唑修饰的新型光敏感型凝胶单体,制备出高效、快速、灵敏的蛋白质光敏固定凝胶,并据此搭建单细胞蛋白质免疫印迹技术平台,实现肿瘤细胞受药物诱导/抑制P-糖蛋白表达异质性及相关耐药机制的研究。而后,设计制备集成微量细胞分离、浓缩、单细胞免疫印迹一体化的微流控芯片平台,用于循环肿瘤细胞化疗耐药异质性及上皮-间质转换异质性的研究。本文具体研究内容如下:（1）高维度质谱流式单细胞蛋白质分析。建立外周血样本前处理方法、细胞样本上机分析方法及数据分析流程,确立成熟的高维度质谱流式单细胞蛋白质分析的实验技术体系,并应用单细胞质谱流式细胞术解析结肠癌免疫表型。应用高维度单细胞质谱流式技术,对结肠癌发生、发展过程中患者外周血免疫细胞族群的分布占比及免疫表型进行分析,尤其是T细胞亚群的免疫检查点分子如Ep CAM、PD-1、PD-L1的表达分析。结果显示,与年龄和性别匹配的健康对照组和结肠息肉患者相比,结肠癌患者外周血Ep CAM+CD4+T细胞占比增多。相较癌旁组织,Ep CAM+CD4+T细胞在肿瘤组织中分布增加,且细胞内pp38 MAPK-p MAPKAPK2信号通路异常激活。（2）低丰度蛋白质单细胞免疫印迹术。制备光敏感型水凝胶单体,并进行性能表征及实现其于单细胞蛋白质免疫印迹中的应用。通过EDCl/HOBt催化的酰胺缩合反应,制备了功能性光捕获产物N-（3-甲基丙烯酰胺丙基）-2-（1-甲基-1H-吡咯-2-基）-2H-四唑-5-羧酰胺（MAP-m Py TC）。通过将合成的MAP-m Py TC与丙烯酰胺及N,N’-亚甲基双丙烯酰胺共聚,可形成改性的光活性聚丙烯酰胺凝胶。采用紫外-可见吸收光谱仪（UV-Vis）、核磁氢谱（~1H-NMR）、核磁碳谱(13C-NMR)、质谱（MS）等对制备的光敏感型化合物进行了表征。采用扫描电镜（SEM）对基于光敏感型化合物制备的水凝胶进行了结构表征,并进行凝胶电泳、免疫印迹性能测试。结果表明,相较于传统光敏型凝胶,基于四唑修饰的光敏感型水凝胶,具有易合成、蛋白质固定效率高、紫外曝光时间短、分离分辨率高、低背景噪音等特征优势,并应用基于该新型光敏凝胶的单细胞免疫印迹术研究揭示了不同肿瘤细胞经药物诱导、抑制P-糖蛋白表达的能力存在明显异质性。（3）微量细胞单细胞免疫印迹芯片。以循环肿瘤细胞为模式微量细胞样本,设计制备循环肿瘤细胞的分离、浓缩、单细胞蛋白质免疫印迹一体化的集成微流控芯片。芯片主要由三个模块构成:1)非标记循环肿瘤细胞快速分离模块:基于惯性聚焦的蛇形微流控通道,实现非标记、快速高通量的循环肿瘤细胞分离,用来实现循环肿瘤细胞的分离;2)在外部出口连接腔室的上部安装了膜过滤器（孔径为20μm）,用于循环肿瘤细胞的纯化和富集;3)在外部出口连接腔室内的底部铺有薄层（200μm）的光敏感性聚丙烯酰胺凝胶带有微孔阵列（微孔深度:30μm）,用于单细胞免疫印迹。应用该多功能芯片实现循环肿瘤细胞化疗药物反应异质性的监测及上皮-间质转换异质性研究的应用,为个体化治疗提供丰富的关键蛋白质的表达信息。本论文建立了单细胞质谱流式细胞术解析结肠癌免疫表型的实验流程体系,并从提升灵敏度/准确度、降低检测样本量要求的角度出发,开发了低丰度蛋白质单细胞免疫印迹术和微量细胞单细胞免疫印迹芯片,为生命科学领域单细胞蛋白质组学及肿瘤异质性研究的蓬勃发展助力。