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登革病毒(dengue viruses, DV)属于黄病毒属(Flavivirus),根据E蛋白的抗原性不同,可分4种血清型(DV2 1-4)。它由主要由埃及伊蚊传播,引起登革热、登革出血热和登革休克综合症。全世界大约有40 %的人居住在热带和亚热带地区,属于感染的高危人群。每年全世界大约有1亿人感染登革出血热,死亡率约为5 %。到目前为止,尚无安全有效的疫苗进行预防和特效抗DV药物进行治疗。可见DV感染已是严重的公共卫生问题。DV2是有包膜的单股正链RNA病毒,基因组全长约11 KD,编码一个多肽链后,在宿主的信号肽酶和病毒编码的蛋白酶作用下裂解为三种结构蛋白(C、prM、E)和七种非结构蛋白(NS1,NS2A,NS2B,NS3,NS4A,NS4B和NS5)。在黄病毒属蛋白酶作用其自身编码的多聚蛋白底物的过程中,需要活化蛋白或者辅助因子使蛋白酶的达到最佳活性,目前认为NS2B即是一个重要的辅助因子,在激活NS3蛋白酶和NS2B–NS3异二聚体中发挥作用,因而成为研究者关注的靶点。NS2B是亚细胞定位在内质网上的一个膜内蛋白。在相对区分NS2B疏水性区域的基础上分为七个区域(Ⅰ-Ⅶ),其中,Ⅳ(G69-E80)为疏水的核心区,能够直接与NS3蛋白酶结合。其侧面的两个亲水性区域(Ⅲ-Ⅴ),用突变的质粒转染到细胞内显示NS2B的40个氨基酸围绕在Ⅲ到Ⅴ区,是最佳刺激NS3蛋白酶的活性区域。而且,通过免疫共沉淀实验证明,NS2B-NS3蛋白酶的活性也是由这个亲水性片段介导的。目前,正在从分子学结构证明NS2B辅助因子激活蛋白酶的活性机制。NS2B除了激活蛋白酶的活性外,还能促进NS3与膜的融合,是NS3诱导细胞发生凋亡的重要辅助因子。NS2B在病毒复制过程中的作用目前尚不十分清楚,重要原因之一是缺乏特异性的显示手段,为进一步研究NS2B蛋白在DV2感染过程中的作用和作为新检测靶抗原的可能性,本课题构建NS2B蛋白的原核和真核表达载体,经过克隆、表达和纯化,制备了抗NS2B的多克隆抗体,为下一步研究工作提供了免疫学工具。本研究主要结果与结论如下:一.DV2 NS2B蛋白的原核表达、抗血清的制备及其生物学特性的初探1. NS2B的原核表达、抗血清的制备利用RT-PCR以DV2 mRNA为模板扩增出DV2 NS2B编码基因NS2B。将NS2B全长基因插入原核表达载体pQE31,转化大肠杆菌JM109,获得的pQE-NS2B/ JM109工程菌经IPTG诱导后,超声裂解提取表达产物,融合蛋白NS2B以包涵体的形式存在。包涵体裂解液经Ni-NTA亲和纯化后,获得大小相符的特异目标蛋白条带。经Western blot证实为所需目的蛋白。目的蛋白经纯化复性后免疫BALB/c小鼠,获得了抗体效价较高的抗血清,经ELISA检测,鼠抗血清效价达到了1:12800。利用Western blot和间接免疫荧光证实,抗血清能特异性地识别DV2 NS2B蛋白。NS2B抗血清的成功制备为进一步研究NS2B在DV2感染机制中的作用提供良好的工具。2. DV2 NS2B多克隆抗体的生物学功能通过PRNT检测,DV2 NS2B产生的抗血清中和病毒的作用不明显,可能不具有免疫保护作用;收集DV2感染后不同时间点的ECV304细胞,免疫荧光检测显示:感染12 h后用NS2B抗血清能检测到NS2B抗原,随着感染时间的延长,NS2B蛋白在细胞内的含量也随着增加;激光共聚焦显示:NS2B蛋白与NS3蛋白在感染12 h、24 h和48 h后的ECV304细胞核周和胞质中有共存区域。二、DVNS2B蛋白在真核表达载体的克隆、表达及其DNA免疫1.真核表达质粒pCAGGS-P7/NS2B的构建通过PCR扩增出DV2 NS2B编码基因。将NS2B全长基因插入真核表达载体pCAGGS,转化大肠杆菌XL-Blue,获得pCAGGS-P7/NS2B XL-Blue工程菌。超纯提取质粒pCAGGS-P7/NS2B DNA后,利用脂质体法瞬时转染细胞Vero,间接免疫荧光染色显示NS2B蛋白的表达,该质粒命名为:pCAGGS-P7/NS2B。2. pCAGGS-P7/NS2B质粒DNA免疫BALB/c小鼠经大规模超纯提取质粒pCAGGS-P7/NS2B DNA后,注射到BALB/c小鼠后,经ELISA检测,鼠抗血清效价达到了1:2000,利用Western blot和间接免疫荧光证实,DNA免疫产生的NS2B抗血清能特异性地识别DV2 NS2B蛋白。本研究分别用原核表达载体和真核表达载构建的NS2B重组质粒,分别以蛋白免疫和DNA免疫的方法,制备抗NS2B抗血清,并通过免疫学方法检测证明这两种方法产生的NS2B抗血清是能够特异性识别DV2 NS2B蛋白。但两种方法各有优势:(1)用蛋白免疫产生的NS2B抗血清比DNA免疫产生的NS2B抗血清效价高,但存在蛋白纯化、复性等较为烦杂的步骤;(2) DNA免疫所获抗体效价略低,但方法较为简便,所产生抗体进行免疫染色时,几乎无非特异性染色。相信在不久的将来,随着DNA免疫原性的提高,这一方法将有有广阔的应用前景。