论文部分内容阅读
艾叶为菊科多年生植物艾Artemisia argyi level.et Vant．的干燥叶，是临床常用的中药。文献报道：艾叶的主要化学成分包括挥发油、黄酮类、甾醇类、萜类、色原酮类和微量元素等；艾叶具有理气血、逐寒湿、温经血、止痛等功用；现代研究证实，艾叶具有镇咳、平喘、祛痰、抗菌、抗病毒、抗过敏、抗癌、增强免疫等多种药理作用。艾叶抗乙肝病毒活性及抗乙肝病毒有效部位研究未见报道。本课题组经体内外实验研究发现艾叶挥发油和乙酸乙酯提取物具有抗乙肝病毒活性，有关研究内容获国家发明专利，为研制艾叶抗乙肝病毒有效部位新药，本文在前期研究基础上对艾叶乙酸乙酯提取物的不同极性部位进行抗乙肝病毒活性的进一步筛选，并对其化学成分进行了分析。艾叶乙酸乙酯提取物不同极性部位的制备。首先是艾叶乙酸乙酯提取物的制备。称取粉碎的艾叶约1Kg，水蒸汽蒸馏法提取挥发油，得艾叶挥发油和水提取液。药渣依次用石油醚、乙酸乙酯、乙醇回流提取，各回流提取两次，每次2h，所得提取液分别合并后浓缩、水浴蒸干、真空干燥，其中得乙酸乙酯浸膏20.6g。其次，依次用石油醚、石油醚-乙酸乙酯（1:1，V:V）、60％乙醇对艾叶乙酸乙酯浸膏进行回流提取，得艾叶乙酸乙酯提取物不同极性部位：石油醚部位（EA-1）5.4g、石油醚-乙酸乙酯（1:1，V:V）部位（EA-2）2.8g、60％乙醇部位（EA-3）2.4g和乙酸乙酯部位（EA-4）2.5g。艾叶乙酸乙酯提取物不同极性部位体外抗乙肝病毒实验。本实验选用抗乙肝病毒体外实验常用的HepG2.2.15细胞为细胞模型，对艾叶乙酸乙酯提取物的四个不同极性部位EA-1、EA-2、EA-3和EA-4进行药理活性筛选。1.采用MTT比色法，观察EA-1、EA-2、EA-3和EA-4对HepG2.2.15细胞的毒性作用。结果表明，EA-1、EA-2、EA-3和EA-4对HepG2.2.15细胞的毒性作用均较低，安全性较高。其中EA-1和EA-3半数毒性浓度（TC50）分别为217.3μg·mL-1和112.4μg·mL-1，EA-2和EA-4均大于200μg·mL-1。2.利用ELISA法，检测EA-1、EA-2、EA-3和EA-4对细胞上清液中HBeAg和HBsAg的影响。结果表明EA-1、EA-2、EA-3和EA-4的三个浓度组均对HBsAg和HBeAg有抑制作用，呈剂量依赖性，其对HBsAg和HBeAg的半数抑制浓度（IC50）依次为：2.63μg·mL-1和7.33μg·mL-1；7.57μg·mL-1和16.34μg·mL-1；3.67μg·mL-1和18.98μg·mL-1；16.88μg·mL-1和31.42μg·mL-1。3.用荧光定量PCR法测定EA-1、EA-2、EA-3和EA-4对细胞上清液和细胞内的HBV DNA拷贝数的影响。结果表明，四个部位对HepG2.2.15细胞HBVDNA均有抑制作用，并呈剂量依赖关系，但抑制效果不及拉米夫定（3TC）。其中EA-1对细胞上清的HBV DNA的半数抑制浓度为39.18μg·mL-1，其他三个部位的抑制能力则较弱。EA-1第九天治疗指数为HBsAg82.6，HBeAg29.6，细胞上清HBV DNA6.8；EA-3第九天治疗指数为HBsAg30.6，HBeAg5.9。综合各部位对细胞上清液中HbeAg、HbsAg以及细胞上清液和细胞内的HBV DNA拷贝数的影响情况，EA-1、EA-2、EA-3和EA-4均具有抗乙肝病毒活性，其中EA-1和EA-3活性较强。对抗乙肝病毒活性较强的EA-1和EA-3两个部位进行了化学成分的初步分析。1.采用硅胶柱层析分离、重结晶纯化，分离得到5个单体化合物，分别为FAA20120831A、 FAA20130430A、 FAA20130430B、 FAA20130430C和FAA20130430D，其中FAA20130430A和FAA20130430C为同一物质，FAA20130430D与前期分离得到的FAA20120313F为同一物质，为3’-甲氧基蓟黄素（5,4’-二羟基-6,7,3’-三甲氧基黄酮）。2.采用TLC自身高（100μg）、低（1μg）浓度对照法，三种不同溶剂系统展开，以及HPLC法对FAA20120831A，FAA20130430B、FAA20130430C进行纯度判定。通过TLC鉴定，FAA20120831A、FAA20130430B和FAA20130430C的纯度均大于99%。用HPLC法对FAA20130430B纯度进行了进一步研究，未发现杂质。由于FAA20120831A和FAA20130430C的紫外吸收弱，没有用HPLC法分析其纯度。3.运用核磁共振氢谱、碳谱、二维核磁共振（DEPT、HMBC、HSQC、1H，1H-COSY）谱图等数据并结合文献对FAA20120831A、 FAA20130430B和FAA20130430C进行分析，FAA20120831A、FAA20130430B分别为达玛二烯醇乙酸酯、5,7,4’－三羟基－3’,8－二甲氧基黄酮，FAA20130430C可能为十六烷酸丙酯。化合物达玛二烯醇乙酸酯和5,7,4’－三羟基－3’,8－二甲氧基黄酮为首次从艾叶中分离得到。本研究首次研究了艾叶乙酸乙酯提取物不同极性部位的抗乙肝病毒活性，并对其成分进行了分析。首次在艾叶中分离得到5,7,4’－三羟基－3’,8－二甲氧基黄酮和达玛二烯醇乙酸酯。为进一步研制抗乙肝病毒有效部位新药奠定了基础。