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目的:在改良子宫内膜细胞原代分离培养方法的基础之上,探讨米非司酮对原代分离培养的人子宫内膜基质细胞增殖的抑制作用。米非司酮对乳腺癌的发生发展是否有抑制作用,及其相关的分子调控机制。 方法:1、通过人子宫内膜原代分离培养,获得子宫内膜基质细胞和上皮细胞。通过流式细胞术检测方法,分别检测鉴定分离培养的基质和上皮细胞的纯度。2采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测米非司酮对原代分离培养人子宫内膜基质细胞的半数抑制浓度(IC50)3.培养人乳腺癌细胞系MCF-7和T47D,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测米非司酮对乳腺癌细胞系MCF-7和T47D的半数抑制浓度(IC50)。4.采用美国Agilent公司人全基因4344K表达谱芯片,检测筛选不同浓度米非司酮(0、0.25、2.5和50μmol/L)处理T47D后差异表达的基因,并通过生物信息学分析。根据筛选出的差异基因,依据基因功能的不同,进行Gene Ontology分析。另外,基于实验已经验证的基因和基因之间的关系,基于KEGG数据库,构建差异表达基因之间的信号转导网络,研究差异基因间的信号转导过程,并从网络中得到起信号中枢作用的基因(Signal-Net)。5.采用RT-qPCR的方法验证全基因组表达谱芯片结果。6.免疫组化法检测米非司酮处理 MCF-7细胞中 BRCA1和BRCA2蛋白的表达,并采用Image-Pro Plus6.0图像分析软件(Media Cybernetics)进行各组图像平均光密度值分析。 结果: (1)通过分离人子宫内膜原代分离培养成功获得了子宫内膜基质细胞和上皮细胞,并通过流式细胞术检测证明通过该原代细胞分离方法可获得高纯度人子宫内膜基质细胞和上皮细胞。 (2)米非司酮可以抑制人子宫内膜基质细胞的增值,其抑制率均随着米非司酮浓度的增加而升高,存在明显的量效关系。 (3)米非司酮对乳腺癌细胞系MCF-7和T47D均有抑制作用,其抑制率均随着米非司酮浓度的增加而变化,存在明显的量效关系。通过对两种细胞IR值直线回归分析,米非司酮对MCF-7细胞的IC50为51.21μmol/L,对T47D细胞的IC50为54.29μmol/L。形态学观察发现,各组细胞体积变小,细胞间的链接消失。25和50μmol/L浓度米非司酮对MCF-7细胞生长抑制作用明显,50μmol/L干预24h后在高倍镜下可见明显的细胞核质浓缩。 (4)米非司酮处理T47D细胞 mRNA基因表达谱芯片检测后,设定基因表现有显著差异的筛选标准为必须符合|FC|要大于2。与对照组相比较,米非司酮25μM处理组上调2250个基因,下调2188个基因。3.通过基因间相互作用网络分析,BRCA1和MYC基因与其他基因相互作用的数目最多,分别33和24,但 HRAS和PRKCA是中介能力比较强的基因,在整个Signal-Net中处于一个关键节点的位置。 (5)挑选了11个关键节点基因进行RT-PCR验证,分别是VEGFA、JAK2、STATS、PIK3CD、MYC、FGFR2、ER、PDGFRA、AR、CDK1、PCNA。RT-PCR结果与芯片结果基本一致。 (6)与米非司酮处理各组相比较,对照组细胞中BRCA1蛋白表达较弱,且细胞胞浆内阳性表达;米非司酮0.25μmol/L组则主要表达于胞浆,少量细胞呈核阳性;2.5μmol/L组 BRCA1蛋白阳性强于其他各组,其细胞核和细胞浆均为阳性。与其他各组相比较,2.5μmol/L组BRCA1蛋白表达量最高,显著高于其他各组(P均<0.05)。对照组细胞中,BRCA2蛋白主要表达于细胞胞浆中;米非司酮各组 BRCA2蛋白阳性较强,细胞胞浆和细胞核中均有表达。2.5μmol/L组表达强度显著高于0.25μmol/L组、25μmol/L组和50μmol/L组比较(P<0.05)。对照组细胞核中BRCA1和BRCA2蛋白阳性表达率[(分别为(19.58%±6.90%)和(36.60%±3.01%)]均较低,显著低于米非司酮其他各组(P均<0.05);2.5μmol/L组和25μmol/L组细胞核中 BRCA1蛋白阳性表达率显著高于0.25μmol/L组和50μmol/L组,差异有统计学意义(P均<0.05);米非司酮处理各组细胞核 BRCA2蛋白阳性率之间差异无统计学意义(P>0.05)。 结论:(1)在改良了子宫内膜细胞原代分离培养方法,二代消化法可以获得高纯度的人子宫内膜基质细胞和上皮细胞。 (2)米非司酮对原代人子宫内膜基质细胞有抑制作用,并呈时间和剂量依赖效应。 (3)米非司酮对不同的乳腺癌细胞系MCF-7和T47D均具有抑制增殖的作用,并呈时间和剂量依赖效应。 (4)米非司酮在蛋白水平上上调乳腺癌细胞系MCF7细胞中BRCA1、BRCA2的表达,但不同浓度米非司酮促蛋白表达模式不同;米非司酮可以促进MCF7细胞中BRCA1、BRCA2蛋白的在核内表达,可能是米非司酮抑制乳腺癌一条重要的分子路径。