【摘 要】
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本文包括红霉素高产菌株的构建和链霉菌SH-62中三个可能的次级代谢产物生物合成基因簇的异源表达这两部分内容:1.红霉素是由红色糖多孢菌(Saccharopolysporaerythraea)产生的
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本文包括红霉素高产菌株的构建和链霉菌SH-62中三个可能的次级代谢产物生物合成基因簇的异源表达这两部分内容:1.红霉素是由红色糖多孢菌(Saccharopolysporaerythraea)产生的一类大环内酯类抗生素,具有广谱的抗革兰氏阳性菌的活性。其中红霉素A作为第二代和第三代红霉素类药物的原料中间体,市场需求巨大。本研究从包含有完整红霉素生物合成基因簇的BAC质粒13G3出发,通过λRed重组酶系统对其进行改造,得到两种不同类型的质粒pYPQ01和pYPQ02。然后利用接合转移将它们依次导入到红色糖多孢菌中,最后获得可能含有两个拷贝红霉素生物合成基因簇的菌株S.ery::pYPQ01和可能含有三个拷贝红霉素生物合成基因簇的菌株S.ery::pYPQ0l+pYPQ02。HPLC和LC-MS分析发现这两株基因工程菌中红霉素A的产量分别为野生型的3.1倍和6.4倍,从而证实增加基因簇拷贝数的研究策略能够成功的应用于红霉素高产菌株的构建,并且效果十分显著。2.链霉菌SH-62是我校周啟教授从湖北房县分离得到的一株具有良好生物活性的链霉菌。生物信息学分析发现该链霉菌的基因组中包含有一个可能的潮霉素A生物合成基因簇(hgm),一个可能的有效霉素生物合成基因簇(vlw)和一个羊毛硫抗生素合成基因簇(lan)。使用7对特异性引物,通过PCR扫描的方法对链霉菌SH-62的基因组BAC文库进行筛选,共获得8个阳性克隆。将这些阳性克隆分别导入到白色链霉菌Streptomycesalbus和变铅青链霉菌Streptomyces lividans ZX1中进行异源表达。通过生物活性测定、HPLC和LC-MS等方法对其发酵产物进行检测,发现hgm基因簇的异源表达不能合成潮霉素A,而是产生一种具有抗真菌活性的物质,其分子式可能为C28H28N604或者C27H32N2O8。lm基因簇异源表达产生的不是有效霉素,而是另一种具有抗真菌活性的化合物,LC-MS分析其分子式可能为C11H9N02。将lan基因簇导入到白色链霉菌且albus中,得到一株可以抗革兰氏阳性菌和阴性菌以及真菌的异源表达菌株,将其导入到变铅青链霉菌S.lividans ZX1中得到了两株能够同时抑制革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的异源表达菌株,并且其中一株对真菌也有微弱的抑制作用。
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