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研究背景和研究目的泌尿系感染(Urinary tract infections,UTIs)是复发率最高最常见的细菌感染之一。流行病学研究表明UTIs在全世界每年影响超过1亿人,UTIs的高发病率给人类健康和社会经济造成巨大的负担,流行病学显示大约50%的女性在其一生中至少经历过一次尿路感染,约25%的女性在初次UTIs后的6个月内会再次感染。大多数的尿路感染是由尿路致病性大肠埃希菌(urinary pathogenic Escherichia coli,UPEC)引起的,在 UTIs 的发生过程中,UPEC可以粘附并侵袭膀胱上皮细胞,从而触发泌尿道的病理变化。目前,由于抗生素耐药率不断提高,有效治疗UTIs变得更具挑战性。细胞焦亡是细胞程序性死亡的一种独特形式,它依赖于细胞质炎性小体的活化。多项研究表明,细胞焦亡在许多感染性和非感染性疾病中起着至关重要的作用。NOD样受体热蛋白结构域3(NLRP3)是一种胞质受体,在先天免疫相关的感染中发挥着至关重要的作用,也是近年来研究最多的炎性小体。NLRP3的激活可以导致半胱天冬酶1(caspase-1)的成熟。活化后的caspase-1是一种半胱氨酸依赖性蛋白酶,可将细胞因子IL-1β和IL-18转变为具有生物学活性的成熟形式。最近,越来越多的证据表明,炎性小体介导的细胞焦亡的发生和宿主应对细菌感染的反应有着密切的关系。肥大细胞是一种具有多种功能的免疫细胞,可以维持和调节免疫功能,并可能使上皮屏障功能紊乱。在炎症过程中,肥大细胞可以通过未知机制介导上皮通透性增加。尿路上皮屏障功能异常与包括尿路感染在内的多种膀胱疾病显著相关。最近的研究结果突出了肥大细胞在宿主对UPEC的反应中的作用,因此本研究的目的是探究在UPEC感染期间膀胱尿路上皮细胞焦亡的作用及发生焦亡的尿路上皮细胞与肥大细胞之间的相互作用,并研究这种作用对膀胱尿路上皮屏障功能及细菌性膀胱炎进展的影响。研究方法使用尿路致病性大肠杆菌CFT073感染6-8周C57BL/6J雌性小鼠24h后应用免疫印迹及免疫组织化学染色等方法分析焦亡相关蛋白表达,caspase-1活性试剂盒用于检测caspase-1活性;体外使用CFT073刺激膀胱上皮细胞,使用免疫印迹实验及ELISA检测焦亡相关蛋白表达,caspase-1活性试剂盒用于检测caspase-1活性;6-8周C57BL/6J雌性小鼠给予caspase-1抑制剂VX-765处理后,膀胱灌注尿路致病性大肠杆菌CFT073悬液24h后行组织匀浆后进行细菌培养观察细菌菌落数变化;石蜡包埋膀胱组织后切片行H&E染色、免疫荧光染色观察细菌侵入程度、膀胱上皮屏障完整性及肥大细胞的浸润程度;为了研究细胞焦亡和肥大细胞的相互作用,细胞实验验证膀胱上皮细胞焦亡释放的IL-1β及IL-18对肥大细胞的趋化作用;免疫印迹及免疫荧光检测肥大细胞释放的类胰蛋白酶(tryptase)对膀胱上皮细胞蛋白酶激活受体2(PAR2)的激活作用以及对膀胱上皮屏障功能的影响;6-8周C57BL/6J雌鼠给予PAR2抑制剂FSLLRY-NH2处理抑制tryptase-PAR2轴后,膀胱灌注尿路致病性大肠杆菌CFT073悬浮液24h后行组织匀浆后进行细菌培养观察细菌菌落数;石蜡包埋膀胱组织后切片行H&E染色、免疫荧光染色观察细菌侵入程度及膀胱上皮屏障完整性。研究结果免疫印迹及caspase-1活性实验结果显示CFT073感染后在体内和体外实验均可激活NLRP3炎性小体并引起caspase-1活化导致IL-1 β及IL-18释放和膀胱上皮细胞焦亡的发生,为了研究细胞焦亡在膀胱感染中的作用,进一步探究焦亡对膀胱炎进展的影响,通过将小鼠给予caspase-1抑制剂VX-765处理后,膀胱灌注尿路致病性大肠杆菌CFT073制造感染模型,使用H&E染色、免疫荧光染色评估小鼠膀胱感染情况,我们发现抑制caspase-1活化可降低膀胱细菌载量和膀胱组织水肿程度,并减轻细菌对膀胱上皮屏障功能的破坏;同时抑制膀胱上皮焦亡可以减少肥大细胞在膀胱组织中的聚集。为了探究膀胱上皮细胞焦亡和肥大细胞之间的相互作用,通过细胞实验我们发现膀胱上皮细胞焦亡释放的IL-1 β及IL-18对肥大细胞的趋化作用,类胰蛋白酶作为肥大细胞的主要功能蛋白可与膀胱上皮的PAR2受体结合诱导ERK的磷酸化引起细胞连接蛋白ZO-1、E-cadherin的降解,导致膀胱上皮屏障功能的破坏;雌鼠给予PAR2抑制剂FSLLRY-NH2处理抑制肥大细胞tryptase-PAR2轴后,膀胱灌注尿路致病性大肠杆菌CFT073悬浮液,通过H&E染色、免疫荧光染色显示抑制tryptase-PAR2轴可以减轻膀胱屏障功能的损害和膀胱炎的进展。研究结论发生焦亡的膀胱上皮细胞可以趋化肥大细胞在膀胱组织中聚集,这种的相互作用通过激活了类胰蛋白酶-PAR2轴导致了细菌性膀胱炎中膀胱上皮屏障功能的损伤,这一系列过程在膀胱炎的发生发展中发挥了重要作用,因此,控制膀胱上皮细胞焦亡的发生及类胰蛋白酶-PAR2轴的激活是治疗细菌性膀胱炎的潜在靶点。