论文部分内容阅读
白细胞介素-2(Interleukin-2,IL-2)主要是由T淋巴细胞或T淋巴细胞系分泌产生的一类最有力的T细胞生长因子,属于Thl型细胞因子。IL-2是一种糖蛋白,具有广泛生物活性,能够有效地提高免疫功能,具有诱导T细胞增殖和分化,诱导白细胞介素-2受体(Interleukin-2 receptor ,IL-2R)的表达;促进B细胞分化、增殖及分泌抗体,同时活化B细胞表达高亲和力IL-2R;可诱导和增强NK细胞、单核细胞等的杀伤活性,也可促进其他细胞因子的分泌以及刺激T细胞在体外的生长;增强淋巴细胞和内皮细胞表面黏附因子的表达,促进淋巴细胞及其它活化细胞的粘附及移动能力;增加抗原递呈细胞表面MHCⅠ和Ⅱ类分子的数量,增强抗原递呈作用。在免疫应答系统中起着极其重要的调节作用,是一种天然的免疫增强佐剂。参照gene bank已发表的绿头鸭IL-2基因序列,自行设计并合成一对特异性引物,以经有丝分裂原ConA活化的30日龄雏番鸭脾淋巴细胞总RNA为模板,应用RT-PCR方法扩增出片段大小为423bp的目的片段,将扩增片段通过T-A策略连接到克隆质粒pMD18-T载体上,经PCR鉴定、酶切鉴定以及DNA序列测定,证明克隆片段为番鸭IL-2基因。该基因涵盖番鸭IL-2基因的全部开放阅读框(ORF),编码140个氨基酸组成的蛋白质。与gene bank中报道的番鸭IL-2基因序列有100%的同源性,与绿头鸭IL-2基因序列进行比较,在ORF内有7个碱基不同,但其推导编码的氨基酸二级结构完全相同。通过二级结构预测表明,它们含有类似于哺乳动物的α螺旋。IL-2基因序列分析表明,番鸭IL-2基因与其它品种禽类IL-2基因有较高的同源性,从而进一步证明了番鸭IL-2基因具有较强的保守性。应用DNA重组技术,将番鸭IL-2基因亚克隆到GST融合基因表达载体pGEX6P-1的相应位点中,将鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。通过IPTG诱导,在大肠杆菌中表达了重组番鸭IL-2蛋白。SDS-PAGE电泳结果显示,在相对分子量40KD(融合蛋白)处有明显的蛋白质表达条带,35℃、0.1mM IPTG、诱导3小时表达量最多。结果表明,pGEX-IL2能够表达GST-IL2融合蛋白,其中番鸭IL-2分子量为14KD,与预期的番鸭IL-2成熟蛋白大小一致。经过超声波裂解、离心和初步分离后,表达产物主要在包涵体中。番鸭IL-2基因原核表达的成功,为其在免疫增强剂和免疫佐剂方面应用研究奠定基础。