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目的:TNF-α是一种重要的炎症因子,TNF-α/TNFR信号通路在炎症性疾病中扮演着重要的角色。本课题组前期利用青环海蛇毒腺噬菌体展示文库筛选得到抗炎活性肽Hydrostatin-SN10,具有TNFR1靶点选择性。本文拟利用巨噬细胞炎症模型与IL-10基因敲除小鼠结肠炎模型,研究Hydrostatin-SN10的体内外抗炎作用,并探讨其抗炎作用机制。方法:1、体外细胞模型RAW264.7和BMDM评价Hydrostatin-SN10的抗炎效果:CCK-8检测LPS诱导的RAW264.7细胞增殖活性;Griess试剂、RT-PCR检测LPS诱导的RAW264.7与BMDM细胞的NO生成、炎症因子的表达水平。2、Hydrostatin-SN10抗炎机制的研究:Western Blot技术检测IκB-α的水平;免疫荧光技术检测NF-κB的核转移水平;RT-PCR检测NF-κB调控基因的表达水平。将未标记的Hydrostatin-SN10、重组TNF-α、抗TNFR1单抗分别与已结合荧光标记Hydrostatin-SN10的细胞孵育1h后,观察荧光强度。3、IL-10基因敲除小鼠结肠炎模型评价Hydrostatin-SN10体内抗炎效果:建立IL-10基因敲除小鼠结肠炎模型后,观察Hydrostatin-SN10(800μg/kg)给药后小鼠体重、结肠长度与脾重指数变化,评价其对小鼠结肠炎症状的影响;HE染色观察小鼠结肠组织病理情况;免疫组化观察小鼠结肠组织中TNF-α水平与Treg细胞。结果:1、Hydrostatin-SN10体外抗炎效果:RAW264.7炎症细胞模型结果表明:Hydrostatin-SN10(100 μg/mL)能抑制LPS诱导的细胞增殖活性,且本身不具有细胞毒性;也能抑制LPS刺激的NO生成以及炎症因子的表达;原代巨噬细胞BMDM炎症细胞模型结果表明:Hydrostatin-SN10(100μg/mL)能抑制LPS诱导的NO生成与炎症因子表达水平。2、Hydrostatin-SN10 抗炎机制:Hydrostatin-SN10(100μg/mL)能很好的抑制 TNF-α 诱导的IκB-α的降解、NF-κB的核转移以及其下游调控基因的表达水平;荧光标记Hydrostatin-SN10结果表明Hydrostatin-SN10能与细胞表面的TNFR1结合。3、Hydrostatin-SN10体内抗炎活性效果:IL-10基因敲除小鼠结肠炎模型结果表明:Hydrostatin-SN10(800μg/kg)给药组小鼠体重明显增长,结肠长度增加,脾重指数也有所缓解,疾病症状明显得到改善;HE染色结果表明:Hydrostatin-SN10(800μg/kg)给药组的结肠黏膜完整性明显增加,隐窝排列完整;免疫组化结果表明:Hydrostatin-SN10(800μg/kg)给药组的小鼠结肠组织中TNF-α水平明显下降,Treg细胞水平增加。结论:Hydrostatin-SN10具有明显的体内外抗炎活性,且Hydrostatin-SN10能结合细胞表面的TNFR1,从而抑制TNF-α的生物活性。