论文部分内容阅读
可传播性海绵状脑病(Transmissible spongiform encephalopathies, TSEs),亦称朊病毒病(Prion disease)是一类由朊病毒引起的人类和动物中枢神经系统的退行性疾病,潜伏期长,致死率100%。朊病毒病包括人类的克雅氏病(Creutzfeldt-Jacob disease, CJD)、库鲁病(Kuru)、致死性家族型失眠症(Fatal Familial Insomnia, FFI)、变异性CJD (variant CJD）、羊的瘙痒病(sheep scrapie)、牛的海绵状脑病(Bovine Spongiform Encephalbpathy, BSE)等。朊病毒(prion)是一种不含核酸、具有自我复制能力的感染性蛋白粒子。PrP106-126肽是朊蛋白富含β-折叠结构的第106位到第126位氨基酸残基,在体外可形成类淀粉样纤维,与prpSc在纤维聚集和蛋白酶抗性方面有着很强的相似性。同时,PrP106-126肽形成的原纤维具有明确的细胞毒性作用。由于朊病毒至今尚无纯化的毒株存在,因此,PrP106-126多肽已成为研究朊病毒细胞学的重要模型之一。多项研究表明,14-3-3参与了朊病毒病的病理发生过程。14-3-3蛋白是细胞中重要的一类抑制细胞凋亡的蛋白,14-3-3主要是以同源或异源二聚体形式发挥其抗凋亡作用,14-3-3的N端是此类蛋白同源或异源二聚体形成的结合位点。我们先前的研究已证明PrP可以通过第106位到第126位氨基酸区域与14-3-3β的N端发生相互作用,并且PrP第110位氨基酸是PrP和14-3-3p的发生相互作用的关键位点之一。为了进一步了解14-3-3蛋白在朊病毒致病机制中的作用,本研究以具有异常朊蛋白特征的PrP106-126多肽为研究对象,观察PrP106-126多肽和PrP蛋白对14-3-3蛋白二聚体形成的影响。将原核表达的14-3-3β蛋白分别与原核表达的重组人PrP蛋白、人工合成的PrP106-126多肽在37℃条件下共孵育2h,通过非变性聚丙烯酰胺凝胶的Westernblot检测14-3-3蛋白二聚体的形成。结果发现PrP蛋白可以使14-3-3β二聚体的形成增加,PrP106-126干扰了14-3-3β二聚体的形成。为了研究PrP106-126多肽中110位氨基酸位点对14-3-3β二聚体的形成的影响,我们将PrP106-126多肽的110位精氨酸突变为甘氨酸,结果发现PrP106-126K110G突变多肽没有影响14-3-3β二聚体的形成。将重组的PrP蛋白、PrP106-126与14-3-3β在37℃条件下共同孵育,结果发现PrP蛋白可以拮抗PrP106-126多肽的对14-3-3β二聚体的解聚作用。将PrP106-126多肽作用于HeLa细胞后发现,PrP106-126多肽可以干扰细胞内的14-3-3二聚体的形成,具有浓度依赖性。PrP106-126多肽使得细胞内的Bax与14-3-3蛋白的结合能力下降,引起Bax的定位改变而诱导细胞凋亡的现象。提示PrP106-126多肽通过解聚14-3-3二聚体的形成,使得Bax与14-3-3蛋白解离并转位到细胞器膜上,从而诱发细胞凋亡。而PrP106-126K110G多肽刺激HeLa细胞后并没有引起明显的14-3-3β蛋白二聚体解聚的现象,再次说明PrP106-26肽的110位的氨基酸是其在14-3-3蛋白二聚体解聚作用的关键位点。综上所述,我们通过非变性聚丙烯酰胺凝胶的免疫印迹、胞浆胞膜分离后的Bax检测、免疫共沉淀等一系列方法证明了PrP106-126多肽在体外和体内均抑制了14-3-3二聚体的形成。我们的实验也证明了PrP106-126通过干扰14-3-3蛋白二聚体的解聚而导致14-3-3蛋白结合的Bax蛋白解离并出现了膜定位的改变。而且,体外实验还证明PrP蛋白可以拮抗PrP106-126对14-3-3β二聚体的形成的干扰作用,提示PrP可能通过增强14-3-3二聚体的稳定来发会其保护细胞的作用的。