随着呼吸机辅助通气的开展及早产儿管理技术的日益提高和肺表面活性物质(pulmonary surfactant，PS)的广泛应用，早产儿，尤其是极低出生体重儿的存活率有了明显提高，随之而来因长时间吸入高浓度氧所导致的早产儿支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia，BPD)却成为威胁早产儿健康和生命的重要疾病。因其发病机制尚不十分清楚，目前仍无有效的防治手段，这导致大概10～15％的患儿因严重的肺纤维化于生后1年内死于呼吸衰竭，存活者也因肺功能障碍需长期的依赖吸入氧气或口服激素甚至是机械通气。　　氧疗是临床上非常重要的治疗手段，但高氧所导致的肺损伤其不能回避的严重副作用之一。高氧可以导致炎症，肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡，反应性增生，活性蛋白表达的改变，肺泡间隔增宽，间质纤维化从而导致早产儿出现支气管肺发育不良。肺泡Ⅱ型上皮细胞为高氧导致肺损伤的主要靶点，研究高氧引起的肺泡上皮细胞内分子机制可以更好的应用辅助氧治疗。　　肺表面活性物质的缺乏和不成熟是发展成为支气管肺发育不良的重要因素。由肺泡Ⅱ型上皮细胞分泌的肺泡表面活性物质蛋白(SP)可以降低肺泡表面张力，防止肺萎缩和保持功能残气量。SP共分四个亚型，SP-A，SP-B，SP-C，SP-D。SP-A，SP-D主要功能为参与宿主防御，SP-B，SP-C的主要功能为降低肺泡表面张力。有实验表明，成年鼠吸入高浓度的氧可以促使肺泡表面活性物质分泌增加从而保护肺脏免于高氧的毒性损伤。疏水的SP-C被证实与板层小体的形成和分泌有关，而板层小体在形成肺表面活性物质单侧及降低肺泡表面张力起到重要的作用最近的研究表明，大鼠刚出生时肺泡表面活性物质蛋白的浓度较高，吸入正常浓度氧，肺泡表面活性蛋白的浓度逐渐下降，吸入高浓度氧的则SP-A，SP-B，SP-D的表达上升，但SP-C却无表达上升，在高氧条件下SP-C的表达和分布的机制尚不明确。　　本研究尝试阐明高浓度氧导致SP-C在新生大鼠的肺组织中，大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞中，M LE-12细胞中堆积，自噬参与其发生过程。高氧诱导通过激活非经典自噬通路JNK信号分子上调自噬相关基因Atg7的表达，从而介导了SP-C在肺泡Ⅱ型上皮细胞中的堆积。　　实验材料和方法:　　一、动物模型制备　　将新生的Wistar大鼠（连同母鼠）于生后12小时内置于氧箱中，持续输入氧气，维持FiO2=0.85，CO2浓度＜0.5，温度25～27℃，湿度50～70％。每天定时开箱0.5小时，添加水、饲料及更换垫料，并与对照组交换母鼠以避免因氧气中毒致喂养能力下降。对照组FiO2=0.21（即空气），具体方法及实验控制因素同实验组。　　二、细胞模型制备　　小鼠肺泡Ⅱ上皮细胞MLE-12细胞（美国，ATCC）。应用HITES培养液（参考ATCC的标准培养方法），在37℃、5％CO2条件下将细胞按100，000细胞/孔接种在六孔板中培养。待细胞生长融合后，暴露至高氧环境(80％O2+5％CO2)进行后续实验。　　三、实验标本采集及处理　　每组分别于实验后1、3、5、7、14d随机选取8只大鼠，处死后无菌取肺组织，用于肺形态学观察免疫组织化学检测的标本置于4％多聚甲醛中固定;用于超微结构观察的标本置于2.5％戊二醛中固定;Western Blot检测的标本置于Eppendorf管内，于-80℃冰箱中冻存。　　肺泡盥洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)的采集;大鼠于鲁米那麻醉后，正中切开颈部皮肤，暴露气管，插人套管针并固定，继之向肺内缓慢注入生理盐水0.5ml，然后回抽，反复操作3次，收集BALF，按3000g/min的速度离心10分钟，小心吸取上清液保存Eppendorf管内-80℃冻存待测。　　四、实验方法及检测指标　　（一）体内试验研究　　1.免疫组织化学方法检测SP-C在新生大鼠肺组织切片中的表达　　2.Western blot方法检测SP-C在新生大鼠肺组织中的表达　　3.透射电镜观察AECⅡ超微结构　　4.ELISA方法检测BALF中SP-C的蛋白含量　　（二）体外实验研究　　1.Western blot方法检测SP-C在MLE-12细胞中的表达　　2.应用免疫荧光的方法检测SP-C在MLE-12细胞中的分布　　3.透射电镜观察MLE-12细胞的超微结构　　4.ELISA方法检测细胞培养液上清中SP-C的蛋白含量　　5.利用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine，3-MA）预处理MLE-12细胞后，检测SP-C的表达情况　　5.1 Western blot方法检测SP-C在MLE-12中的表达　　5.2.应用免疫荧光的方法检测SP-C在MLE-12细胞中的分布　　5.3透射电镜观察MLE-12细胞的超微结构　　5.4 ELISA方法检测细胞培养液上清中SP-C的蛋白含量　　6.检测Atg7调节SP-C在MLE-12细胞中的堆积　　6.1 Western blot方法检测Atg7在MLE-12细胞中的表达情况　　6.2 SiRNA处理Atg7后Western blot方法检测Atg7在MLE-12细胞中的表达　　6.3 SiRNA处理Atg7后Western blot方法检测SP-C在MLE-12细胞中的表达　　6.4 SiRNA处理Atg7后免疫荧光的方法检测SP-C在MLE-12细胞中的表达　　6.5 SiRNA处理Atg7后ELISA方法检测细胞培养液上清中SP-C的蛋白含量　　7.检测高氧是否通过激活JNK通路上调Atg7的表达　　7.1分别应用MAPK抑制剂U0126，SP600125，SB203580处理MLE-12细胞后Western blot方法检测SP-C在细胞中的表达　　7.2分别应用MAPK抑制剂U0126，SP600125，SB203580处理MLE-12细胞后ELISA方法检测细胞培养液上清中SP-C的蛋白含量　　7.3分别应用JNK抑制剂SP600125或SiRNA JNK MLE-12细胞后Western blot方法检测Atg7在MLE-12细胞中的表达情况　　7.4分别应用JNK抑制剂SP600125和SiRNA JNK MLE-12细胞后免疫荧光方法检测SP-C在MLE-12细胞中的表达　　五、统计学分析　　应用SSPS11.5统计软件分析，计量资料采用t检验，显著性检验水平为0.05。　　结果:　　（一）体内试验研究　　1免疫组化学结果表明，随高氧暴露时间延长，SP-C在新生大鼠肺组织内表达逐渐增加;　　2.Western blot结果表明，随高氧暴露时间延长，SP-C在新生大鼠肺组织内表达逐渐增加　　3.随高氧暴露时间延长，肺泡Ⅱ型上皮细胞内可见板层小体逐渐增多，并且观察到在自噬小体内出现板层小体样结构;　　4.ELISA结果表明BALF中SP-C的蛋白含量随高氧暴露时间延长而逐渐减少;上述实验结果表明，在高氧刺激下，新生大鼠肺组织中肺泡Ⅱ细胞内SP-C表达水平逐渐增多，并且堆积在细胞内，被细胞内自噬体吞噬。　　（二）体外实验研究　　1.Western blot结果表明，随高氧刺激时间延长，SP-C在MLE-12细胞内表达水平逐渐增加;　　2.免疫荧光实验结果表明，随高氧刺激时间延长，SP-C在MLE-12细胞内荧光信号的强度逐渐增加;　　3.透射电镜的结果表明，在高氧刺激的作用下，在MLE-12细胞内可见板层小体数目逐渐增多，且呈现空泡状改变，并且被自噬小体所吞噬;　　4.ELISA结果表明，在高氧作用下的MLE-12细胞培养液上清中SP-C蛋白含量随时间延长而逐渐减少;　　5.利用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)预处理MMLE-12细胞，抑制细胞自噬功能，进一步分析SP-C的表达变化情况:　　5.1 Western blot结果表明，加入自噬抑制剂3-MA后SP-C在MLE-12细胞中的表达逐渐降低;　　5.2免疫荧光实验表明，自噬抑制剂3-MA可以明显抑制SP-C在MLE-12细胞中的表达;　　5.3自噬抑制剂3-MA处理后，透射电镜观察到MLE-12细胞内板层小体数量减少　　5.4 ELISA结果表明，自噬抑制剂3-MA可以明显增加MLE-12细胞培养液上清中SP-C蛋白的含量;　　6.分析SP-C在MLE-12细胞中堆积的分子机制　　6.1 Western blot结果表明，随高氧时间延长，自噬相关基因Atg7在MLE-12细胞内表达水平的逐渐增加;　　6.2.应用RNA干扰技术成功下调MLE-12细胞中Atg7的表达;　　6.3可以明显抑制高氧刺激所致的MLE-12细胞内的SP-C表达水平的增加;　　6.4免疫荧光结果表明，下调MLE-12细胞中Atg7的表达明显减弱高氧刺激所致的MLE-12细胞内SP-C的堆积;　　6.5 ELISA结果表明，下调MLE-12细胞中Atg7的表达可以明显抑制高氧刺激所致的MLE-12细胞培养液上清中SP-C含量的减少;　　7.进一步分析高氧诱导MLE-12细胞中Atg7表达上调的分子机制:　　7.1用不同MAPK信号分子抑制剂U0126，SP600125，SB203580预处理MLE-12细胞后，发现特异性JNK信号分子抑制剂SP600125可以明显抑制高氧所致的MLE-12细胞内SP-C表达水平增加，细胞培养上清液中SP-C的减少以及MLE-12细胞内SP-C免疫荧光信号的增加，同时可以明显抑制细胞内自噬相关基因Atg7表达水平的增加;　　7.3应用JNK抑制剂SP600125预处理细胞后或利用JNK SiRNA抑制细胞内JNK信号分子的活化后，可以明显抑制细胞内自噬相关基因Atg7表达水平的增加及SP-C表达水平的增加。　　结论:　　1、高氧条件下，SP-C在新生鼠的肺组织肺泡Ⅱ细胞及体外培养的MLE-12细胞中表达水平增加，但肺泡盥洗液中和细胞培养上清液中含量的减少说明SP-C在肺泡Ⅱ细胞中堆积，提示高氧可以导致SP-C出现外分泌障碍。　　2、高氧可以明显诱导肺泡Ⅱ细胞内自噬相关基因Atg7表达水平的增加，抑制细胞内Atg7的表达可以明显缓解细胞内SP-C的堆积，促进SP-C向细胞外分泌，提示自噬相关基因Atg7可能参与了高氧所致肺泡Ⅱ细胞内SP-C的分泌障碍。　　3、高氧通过激活致肺泡Ⅱ细胞内JNK信号通路从而上调Atg7的表达，激活细胞内自噬导致SP-C在肺泡Ⅱ型上皮细胞的堆积。