研究背景乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染是一个全球性的健康问题，全世界大约有3.5亿人发生慢性HBV感染。在我国，慢性HBV感染是导致肝硬化和肝细胞癌(HCC)的重要原因之一。HBV基因组是部分双链的环状DNA分子，其负链核苷酸序列上至少有4个相互重叠的开放读码框：C、S、P和X基因，分别编码病毒的核衣壳蛋白、外膜蛋白、DNA多聚酶和具有反式激活作用的X蛋白。近年来的研究表明，HBV的变异率较其它DNA大约高10倍，HBV基因变异与疾病的临床转归相关，变异株可导致致病性和复制能力增加、改变宿主免疫应答的重要表位以及产生对抗病毒药物的耐药性。由于HBV的不同编码基因相互重叠，启动子和增强子等调控序列又位于编码基因之内，某个部位的基因突变将影响多个基因的表达，从而形成HBV基因变异，因此，更全面地研究乙型肝炎病毒基因组的变异及其生物学意义尤为重要。目前的研究发现在慢性HBV感染中肝细胞的损伤并非是病毒的直接作用，而主要是宿主针对病毒感染肝细胞表达抗原的免疫应答所致。HBV血清亚型分类是依据各亚型表面抗原的差异而建立的血清学分类方法，根据HBV表面蛋白的抗原决定簇不同，把HBV分为9个血清亚型，但不能确切反映病毒基因的异质性。目前依据全基因序列的异质性大于或等于8％将HBV分为A-H 8个基因型，并发现基因型有一定的地理分布且与疾病的临床转归以及肝癌的临床特征有一定的相关性，但我国对HBV基因型分布及其临床意义的研究较少，特别是缺乏基因型和HCC之间的相关性研究。因此有必要建立一种简单、易行、快捷的分型方法，以便进行大规模分子流行病学调查，并探讨基因型和HCC的关系。目的建立用多对型特异性引物-聚合酶链反应法检测HBV的基因型。了解湖北地区HCC患者HBV基因型的分布；并探讨不同基因型与肝癌临床特征的相关性。方法利用多对型特异性引物-聚合酶链反应法检测HBV的基因型，选取分型为C基因型的样本用高保真DNA聚合酶PCR经分离、纯化、筛选和酶切鉴定，获得的阳性克隆用CEQ2000XL全自动测序仪测序，结果与Genebank发表的HBV序列进行同源性分析，用最大相似法绘制HBV全S基因发生树，邻近法验证。选择湖北地区HBV DNA阳性的慢性HBV感染患者297例，其中表面抗原携带者(ASC)52例、慢性肝炎(CHB)56例、重型肝炎32例、肝硬化22例和HCC 135例，用多对型特异性引物-聚合酶链反应方法检测HBV的基因型；比较肝癌和肝炎患者基因型的分布；进一步分析135例HBV DNA阳性HCC患者HBV的基因型分布情况，分析HCC患者HBV基因型与HBVDNA水平和HBeAg阳性率、ALT AST TBIL AFP的水平、肝癌病理分级及生存率等临床特征的相关性。结果多对HBV型特异性引物-聚合酶链反应法可以简易快速准确鉴定HBV基因型。鉴定出297份HBV DNA阳性血清标本中，B基因型218例(73.4％)，C基因型65例(21.9％)，BC混合型14例(4.7％)，未发现A、D、和E基因型；我们比较CHB与HCC患者的HBV复制程度发现，HCC患者的血清HBV DNA水平和HBeAg阳性率均显著低于CHB。135例HCC患者中，B基因型102例(75.6％)、C基因型26例(19.2％)、BC混合基因型7例(5.2％)；不同年龄、性别和HBV基因型无明显关系；C型HBV DNA水平及HBeAg阳性率明显高于B型；C型ALT AST TBIE AFP的水平均较B型高，差异有显著性；1年生存率B型84.42％，C型仅为69.57％；三组基因型与肿瘤病理分级之间无显著性差异。结论确定多对型特异性引物-聚合酶链反应检测HBV基因型的方法简易、快速、准确；该方法可用于HBV基因型的流行病学调查；湖北地区存在HBV的B、C和BC混合基因型，B基因型为HCC患者的优势基因型；HCC患者HBV不同基因型与HCC的临床特征有相关性，C型HBV DNA水平明显高于B型，肝脏损害较重，生存率低。本课题的创新点1、确定多对型特异性引物-聚合酶链反应检测HBV基因型的方法简易、快速、准确。2、研究了湖北地区HCC患者HBV的基因型分布，发现B基因型为本地区的优势基因型，并与疾病的活动相关。3、在国内首次较全面的研究了HCC患者HBV不同基因型与肝癌临床特征的相关性。本课题的意义1、证明多对型特异性引物-聚合酶链反应检测HBV基因型的方法简易、快速、准确，为在基因水平上研究HBV基因变异的生物学意义，进行HBV的分子流行病学调查提供了可靠的方法。2、了解了湖北地区HCC患者HBV基因型的分布，为进一步更准确建立我国HCC患者HBV不同基因型的参照序列提供了依据。3、初步探明了HCC患者HBV不同基因型与肝癌临床特征的关系，为进一步深入研究HBV基因型和HCC分子生物学特征的关系，早日揭开HBV诱导HCC发生的机理奠定了基础。