背景胰岛素样生长因子1（Insulin-like Growth Factor 1,IGF-1）和IGF-2在许多肿瘤中表达异常,导致病人预后不良,是分子靶向药物开发的理想靶标。单链抗体（Single-chain Antibody,scFv）是把单抗的重链可变区和轻链可变区通过一个柔性小肽连接而成,具有分子量小、穿透力强、免疫原性低、易于构建等优点。噬菌体展示技术（Phage Display Technology）是把抗体DNA片段插入噬菌体外壳蛋白基因中,抗体与外壳蛋白以融合蛋白形式表达在噬菌体表面,采用特定抗原对该噬菌体抗体库进行几轮筛选后即可获得针对特定抗原的单链抗体。本研究首先构建了一个人源性、大容量噬菌体展示单链抗体库,采用IGF-1和IGF-2蛋白作为抗原对其进行了筛选,获得了一种全新的抗IGF-1/IGF-2单链抗体。目的本研究通过噬菌体展示技术构建了大容量的全人源噬菌体展示单链抗体库,从中筛选出一种与IGF-1和IGF-2具有高度亲和力而与胰岛素亲和力相对较低的单链抗体,为下一步研究其体内外抗肿瘤活性提供必要的基础,并且为开发作用于IGF信号系统的靶向药物进行新的探索。方法1.收集50例健康或患者外周血,分离其淋巴细胞,提取总RNA,利用逆转录PCR（Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR）技术扩增抗体的重链可变区基因和轻链可变区基因,之后采用重叠延伸拼接PCR（Overlapping extension splicing polymerase chain reaction,SOE-PCR）技术将其拼接成完整的单链抗体（scFv）基因,并将其插入到pCANTAB-5E噬菌粒载体,电转化至E.coli TG1感受态细胞中,构建初级全人源噬菌体展示单链抗体库。2.随机挑选15个克隆,采用PCR、SfiⅠ和NotⅠ双酶切和测序技术对构建的噬菌体展示单链抗体库的插入效率和多样性、与免疫球蛋白的同源性进行分析,计算库容量。3.以IGF-1和IGF-2蛋白为抗原,通过七轮结合、洗涤、洗脱、扩增,筛选出与IGF-1/IGF-2具有高亲和力的次级单链抗体库。4.从次级抗体库中随机挑取93个克隆通过ELISA方法筛选出与IGF-1/IGF-2亲和力最高的重组噬菌体克隆,通过测序获得单链抗体的DNA序列,在NCBI数据库中进行BLAST分析。5.优化上述scFv的核苷酸序列密码子并全基因合成,之后与表达载体pET30a连接获得重组表达载体pET30a-anti-IGF-1/IGF-2-scFv。6.将pET30a-anti-IGF-1/IGF-2-scFv转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,加入IPTG诱导目的蛋白的表达。取大肠杆菌不同部位成分,包括培养液上清、胞质可溶性组分和包涵体组分进行SDS-PAGE和Western blot检测,观察目的蛋白的表达定位情况。7.对影响蛋白表达产量的各个因素,包括培养温度、IPTG浓度、诱导时间和起始菌体密度进行优化。8.超声波破菌后提取胞质中的包涵体组分,采用Ni²⁺亲和层析法对scFv进行纯化,对目的蛋白分步透析进行复性,BCA法测定浓度,SDS-PAGE和Western blot技术检测单链抗体的纯度。9.ELISA法检测抗IGF-1/IGF-2单链抗体与相应抗原（IGF-1、IGF-2和胰岛素）的亲和活性。结果1.设计简并引物采用RT-PCR方法从50例健康人或患者外周血淋巴细胞总RNA中扩增出了340bp的VH基因,325bp的VL基因,SOE-PCR在二者之间引入（G₄S）₃连接肽获得了scFv基因（VH-linker-VL）,大小约750bp。2.将scFv基因插入到噬菌粒载体pCANTAB-5E并将其电转化至E.coli TG1感受态细胞中,构建出了噬菌体展示单链抗体抗,经计算库容量分别为4.50ⅹ10⁷（kappa链）和3.49ⅹ10⁹（lamda链）。序列比对结果显示各个克隆之间具有良好的多样性,且BLAST比对结果显示抗体库与人免疫球蛋白序列具有高度同源性。3.以IGF-1为抗原对初级抗体库进行三轮的淘筛,再以IGF-2为抗原对抗体抗进行四轮的淘筛,获得了与IGF-1和IGF-2具有高亲和力的抗IGF-1/IGF-2次级单链抗体库。4.从上述次级抗体库中随机挑选93个克隆,采用ELISA方法进行筛选,发现9号克隆与IGF-1、IGF-2蛋白亲和力最高且与胰岛素亲和力相对较低,将9号克隆进行测序,测序结果显示该单链抗体长651bp,其中VH长384bp,VL长222bp,linker长45bp。经Igblast检索,该单链抗体VL类型为kappa链,VH和VL均含有3个互补决定区（CDR）。5.经密码子优化后全基因合成了pET30a-anti-IGF-1/IGF-2-scFv表达质粒基因。将其转化至E.coli BL21（DE3）star^TM感受态细胞,加入IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE及Western blot结果显示,单链抗体在大肠杆菌细胞质中以包涵体形式存在,其分子量约为27kDa。6.目的蛋白表达条件优化结果显示其最优表达条件为:起始菌体密度OD₆₀₀=1.2,IPTG浓度为0.6mmol/L,培养温度37℃,诱导时间为8h。7.在变性条件下采用Ni²⁺亲和层析柱对单链抗体进行纯化,SDS-PAGE结果显示获得的scFv蛋白纯度在90%以上。之后采用逐步减少尿素浓度的分步透析法对变性蛋白进行复性,获得了具有活性的可溶性蛋白,经BCA法定量,每升的发酵液可获得59.53mg的scFv蛋白。8.ELISA结果显示抗IGF-1/IGF-2 scFv与IGF-1、IGF-2、胰岛素的亲和常数（Kd值）分别为7.387μg/ml（0.274μmol/L）、9.437μg/ml（0.35μmol/L）和24.47μg/ml（0.906μmol/L）。结论1.采用噬菌体展示技术成功构建了一个噬菌体展示单链抗体库,该抗体库具有容量大、多样性高、全人源性的特点,为各种单链抗体的筛选和开发提供了一个良好的平台。2.以人IGF-1和IGF-2蛋白作为抗原对上述单链抗体库进行淘筛,获得了一种特异性抗IGF-1/IGF-2单链抗体。3.通过在大肠杆菌中诱导表达、分离纯化和变性复性过程,成功获得了抗IGF-1/IGF-2单链抗体蛋白。4.该单链抗体对IGF-1和IGF-2具有良好的亲和活性,而对胰岛素的亲和性相对较低。